解脂耶氏酵母細胞工廠生產多不飽和脂肪酸的研究進展

何思成 張紫瑗 韓雨晴 苗琳 張翠英 于愛群

（天津科技大學生物工程學院 省部共建食品營養與安全國家重點實驗室 工業發酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業微生物重點實驗室，天津 300457）

多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids,PUFA）是指含有2個或2個以上碳碳雙鍵的長鏈脂肪酸，碳原子數目一般為18-22個［1］。根據距離甲基端第一個雙鍵位置的不同，通常可將PUFA分為ω-3系列和ω-6系列。長期以來，市場上的絕大多數PUFA是從深海魚類中直接提取獲得的，而海洋微藻則是PUFA的次要來源。近年來，海洋環境污染和過度捕撈嚴重破壞了漁業資源，這也極大程度地限制了利用海洋魚類提取PUFA產業的發展［2］。另外，魚油中PUFA會隨著魚的種類、繁殖季節、地理環境等因素改變，這使得提取到的PUFA含量和組成不斷發生變化，少數PUFA在魚油中含量又是較低的。上述因素都造成了傳統的PUFA制備方法難以滿足與日俱增的市場需求，迫切需要開發穩定、高效、可持續、低成本的新型PUFA合成路線［3-4］。

“微生物細胞工廠”是通過對選定的微生物底盤細胞的代謝途徑進行特定改造，創建出滿足定制化需求的生產線，從而加工制造出人類所需的食品、藥品、化學品、燃料、材料等各類型產品，它現已成為合成生物學領域最為典型的應用研究模式和最為重要的前沿發展方向［5-6］。其中，解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）具有多種獨特的生理代謝特征，因此將其作為“微生物細胞工廠”來實現工業產品的合成和生產備受學術界和工業界的高度關注［7］。

總之，目前利用微生物細胞工廠發酵生產功能性PUFA對于解決PUFA資源匱乏問題具有深遠意義，這也吸引了國內外研究人員的廣泛關注［8］。解脂耶氏酵母是異源合成PUFA理想的微生物底盤細胞，近年來利用代謝工程及合成生物學技術在該微生物底盤中重構與優化PUFA的合成途徑成為了領域內的一項研究熱點和發展趨勢。本文首先對PUFA的微生物來源和代謝途徑、解脂耶氏酵母的分子遺傳學操作技術進行了介紹；其次系統總結和梳理了以解脂耶氏酵母作為底盤細胞異源生產PUFA的有關代謝工程實例；最后對利用解脂耶氏酵母細胞工廠生產PUFA存在的主要問題和未來發展方向進行了分析和討論，以期為從事相關研究的科研人員開辟新的思路提供借鑒與依據。

1 PUFA的微生物來源及其合成途徑

PUFA是機體生物膜的關鍵結構組分，同時已有大量研究表明，它作為信號分子參與了對糖代謝、脂代謝、激素代謝等多種生理過程的調控［9-10］。此外，PUFA在機體中還直接或者間接地發揮著抗癌、抗衰老、抗動脈粥樣硬化、降低膽固醇、促進發育、緩解炎癥、提高免疫力等多種生理作用［11-12］，因此其對于機體健康狀態的維持起著十分重要的作用［13-15］。由于PUFA具有上述多種重要的生物學功能，這使其作為功能因子在食品、保健品、醫藥、飼料等多個領域均表現出了很好的開發前景和應用價值［16-18］。表1列舉出了機體中存在的一些重要的PUFA及其生理功能。

表1 生物體中常見的多不飽和脂肪酸類型Table 1 The most common types of PUFA in organisms

目前PUFA的市場需求量巨大，利用細菌、真菌和微藻等微生物生產PUFA具有生長速率快、營養需求簡單、培養條件可控等優勢，因此微生物被認為是替代海洋生物資源生產PUFA的理想原料。與細菌相比，某些微藻和真菌具有較高的PUFA含量。藻類中，一些可進行光合作用的自養型微藻如單胞藻（Monodus subterraneus）、角核指藻（Phaeodactylum tricornutum）、微擬球藻（Nannochloropsis oculata）、金色奧杜藻（Odontella aurita）和紫球藻（Porphyridium cruentum）等都具備合成較高含量EPA的能力［19］；一些無法進行光合作用的異養型微藻如破囊壺菌（Thraustochytrium spp.）和裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum）等則可合成較高產量的DHA［20］。但利用微藻生產PUFA存在著一些明顯的瓶頸和制約因素，如微藻生長緩慢、采收成本高、油脂含量較低等。目前已經證實的天然高產PUFA的油脂真菌主要有高山被孢霉（Mortierella alpina）、深黃被孢霉（Mortierella isabelina）、木霉（Trichoderma spp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、畸雌腐霉（Pythium irregulare）和樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）等絲狀霉菌，以及解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）、圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、斯達氏油脂酵母（Lipomyces starkeyi）、膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、彎假絲酵母（Candida curvata）和曲隱球菌（Crytococcus curvatus）等酵母菌。與微藻相比，這些絲狀霉菌和酵母菌能夠積累較高產量的PUFA，且具有生長速度快、基質原料選擇寬泛、發酵工藝簡單、易于大規模生產等優勢，因此，利用真菌發酵法生產PUFA展現出了更大的研發潛力。近十幾年來，利用高山被孢霉（M. alpina）、深黃被孢霉（M.isabellina）等被孢霉屬菌種發酵合成一種PUFA——ARA，已經成為了ARA的主要工業化生產方法［21］，但被孢霉發酵過程存在生長緩慢、生物量低、易形成絮狀或團塊狀菌球等缺陷。單細胞酵母發酵具有生長速度快、生產周期短、適合高密度培養、生物安全性高等優點，因此有望成為利用微生物發酵法生產PUFA的新的菌種來源［22］。

不同微生物物種所合成PUFA的鏈長以及不飽和程度是有所區別的。酵母菌通常生成的PUFA碳鏈長度大于18，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等常規酵母產生的長鏈脂肪酸主要包括飽和脂肪酸（saturated fatty acids, SFA），即棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）；單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids, MUFA），即棕櫚油酸（C16:1n-7）和油酸（Cl8:1n-9）；不產生任何PUFA［23］；而解脂耶氏酵母等非常規酵母則具有相對完整的PUFA合成途徑［24］。酵母菌生產PUFA主要依靠的是脂肪酸延長去飽和途徑，該途徑以棕櫚酸為底物，并由脂肪酸去飽和酶（也稱脂肪酸脫氫酶，fatty acid desaturase）和脂肪酸延長酶（fatty acid elongase）這兩種酶所構成，去飽和酶和延長酶的種類和數量的差異將造成最終酵母菌合成PUFA種類的差異，去飽和酶的種類和數量則決定了PUFA的不飽和度，是整個合成途徑的關鍵酶。在酵母菌中，PUFA從頭合成途徑始于線粒體中產生的檸檬酸：檸檬酸通過線粒體膜轉運蛋白運輸到細胞質中，一部分檸檬酸被胞質中的ATP檸檬酸裂解酶裂解為合成PUFA的基本二碳單位——乙酰輔酶A［25］；檸檬酸裂解產生的乙酰輔酶A通過脂肪酸合成酶（fatty acid synthase, FAS）生成了棕櫚酸，棕櫚酸再經過一系列碳鏈的交替延長和去飽和作用生成了各類PUFA。圖1展示了解脂耶氏酵母以葡萄糖為底物生產PUFA的內源性合成途徑以及通過代謝工程改造已經在該酵母底盤中所構建的各種PUFA（如ARA、EPA和DHA）的異源合成途徑［26］。

圖1 解脂耶氏酵母中PUFA生物合成途徑示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the PUFA synthetic pathway in Y. lipolytica

2 解脂耶氏酵母合成生物學工具的研究進展

解脂耶氏酵母的全基因組序列已經公布，其遺傳轉化體系經過近十幾年的發展也逐漸成熟并完善。近年來，針對該酵母的合成生物學元件和基因編輯技術也有了蓬勃發展。再加上該酵母具有多種獨特的生理代謝特征，因此解脂耶氏酵母已經成為了當今代謝工程及合成生物學領域中備受關注且極具發展潛力的工業微生物底盤細胞之一。本部分主要對解脂耶氏酵母底盤的合成生物學元件和基因編輯技術進行簡要介紹。

2.1 啟動子

啟動子序列決定了微生物細胞內多數基因的表達水平，也是構建基因表達載體的基本功能組件，因此可以說是最為重要的合成生物學元件之一，選擇并使用合適表達強度的啟動子成為了合成生物學研究中對底盤中特定基因表達進行調控的最常用方法［27-28］。最早從解脂耶氏酵母中分離鑒定并廣泛應用于調控外源基因表達的內源性啟動子包括堿性胞外蛋白酶基因的啟動子pXPR（誘導型強啟動子）［29］和翻譯延伸因子1-α基因的啟動子pTEF1（組成型強啟動子）［30］。誘導型啟動子能夠基于特定誘導物或阻遏物的濃度來調控目的基因的表達，因此在解脂耶氏酵母細胞工廠的構建中顯示出了比組成型啟動子更好的優勢。目前解脂耶氏酵母底盤可用的誘導型啟動子主要包括pLIP2、pPOX2、pPOT1、pXPR2、pICL1等［31-32］。近年來，更多的解脂耶氏酵母內源性啟動子得到了序列克隆與活性初步鑒定，但其功能和應用仍有待于進一步驗證和完善［33-34］。

許多研究表明，對于解脂耶氏酵母底盤來說，強啟動子不一定是提高蛋白質表達水平的最佳選擇［35］。因此，有必要對解脂耶氏酵母內源性啟動子序列及其5'端側翼序列進行分段功能分析，并通過定向或非定向改造開發出轉錄活性更強的人工合成啟動子。例如，利用分段分析方法，研究人員證明了上游激活序列（upstream activating sequence,UAS1B）對pXPR2啟動子活性影響最為顯著。在此基礎上，Madzak等［36］通過在pLEU2啟動子上游添加UAS1B元件構建了人工合成的組成型強啟動子pHP1d、pHP2d、pHP3d和pHP4d；啟動子活性分析結果顯示，人工合成啟動子強度隨UAS1B拷貝數的增加而增加。而pHP4d也是目前在解脂耶氏酵母底盤中得到最廣泛應用的雜合啟動子之一，能夠表現出準組成型的高水平活性。進一步地，Blazeck等［37-38］在pLEU2和pTEF1啟動子上游也分別添加了多個UAS1B元件，結果顯示啟動子活性同樣大大提高，這就再一次證實了UAS1B元件的重要功能。此外，研究人員利用啟動子截短和重排的方法對不同啟動子元件（如核心啟動子、TATA框、近端序列、UAS）進行了功能分析，結果表明了這些序列都是決定解脂耶氏酵母啟動子強度的重要因素［39］。解脂耶氏酵母中天然脂肪酸誘導型酰基輔酶A氧化酶2（pPOX2）啟動子由上游激活序列（A1、A2和A3）、調節序列（R1和R2）以及核心啟動子序列組成，Lv等［40］研究表明pA1R1x2A3啟動子（包括2個A1R1序列和1個pPOX2核心啟動子序列）具有脂肪酸誘導的最廣泛的表達范圍。這些具有不同強度和不同誘導特性的啟動子能夠調控解脂耶氏酵母中PUFA的合成代謝網絡。重要的是，誘導型啟動子具有動態調節解脂耶氏酵母脂肪酸譜的能力，所以在生長階段天然脂肪酸不會減少，反而能夠在積累期快速合成。例如，pYAT1啟動子已被用于調控解脂耶氏酵母PUFA合成途徑中的關鍵基因［41］。表2列出了目前解脂耶氏酵母表達系統中可用的組成型和誘導型啟動子類型。

表2 解脂耶氏酵母表達系統中常用的啟動子Table 2 Most prominently used promoters for heterologous expression in Y. lipolytica

2.2 DNA重組

構建解脂耶氏酵母細胞工廠的首要步驟是需要將外源DNA片段以正確的順序首尾相連，然后插入到目標載體中［48-52］。基于酶切或單元克隆的傳統技術已不能滿足構建具有復雜遺傳功能的微生物細胞工廠的要求。近十幾年來已經開發出了許多針對解脂耶氏酵母的DNA重組策略，如一步PCR法［49］、Gateway克隆［37］、BioBricks［50］、Gibson組裝［51］和Golden Gate［52］等。一步PCR法是利用重疊延伸PCR（OE-PCR）技術，將重疊45或60個堿基的4個基因盒組裝起來，然后將混合片段直接轉化解脂耶氏酵母進行組裝和插入rDNA位點。Gateway克隆允許通過att位點將特定基因從供體載體轉移到多個目的載體中［35］。Wong等［50］研究發現具有4個可調節限制位點的載體（Avr II、Xba I、Spe I和Nhe I）在使用基于BioBrick的組裝時能構建多個模塊化元件。Gibson組裝需要多個兩端重疊約30個堿基片段，以便核酸外切酶生成單鏈懸挑結構，之后DNA聚合酶填充退火區域上的間隙，DNA連接酶密封缺口并將DNA片段共價連接在一起［51］。Engler等［52］研究發現可利用II型限制性內切酶構建標準化和可互換的DNA文庫。值得注意的是，每一種DNA組裝技術都有其優缺點，需要根據具體的基因改造需求來進行使用。OE-PCR和Gibson組裝方法簡單、快速，但每個組分依賴不同的引物，難以組裝含有多個重復序列的DNA片段序列。相反，使用Gateway方法可以容易地重組和改變含有目標基因的重組載體，而BioBricks和Golden Gate更適合高通量文庫的構建［50,53］。這些先進的DNA組裝技術能夠幫助快速組裝需要在解脂耶氏酵母底盤中進行表達的多基因途徑。此外，Golden Gate法已應用于啟動子改組實驗［54］，該實驗有助于篩選到控制不同PUFA合成途徑中限速基因表達的最佳啟動子。

2.3 基因編輯

目前，在解脂耶氏酵母底盤中已經建立了多種基因敲除和整合工具，這為在解脂耶氏酵母染色體上重新設計和構建合成途徑提供了可能性。Cui等［55］開發出了外體質粒，實現了蛋白質簡易表達或快速表征，但這種基因表達方法顯示出了遺傳不穩定性。對于酵母菌而言，傳統的基因組編輯技術主要依賴于非同源末端連接（non-homologous endjoining, NHEJ）或同源定向修復（homologous-directed repair, HR）［56］。在解脂耶氏酵母中，利用NHEJ和營養缺陷型或抗生素抗性選擇標記可以將外源基因隨機整合到基因組中。修復DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）的主要方法是通過NHEJ而不是HR［54］。NHEJ過程的隨機性阻礙了插入位點的精確控制，但這一特性反過來又可用于生成染色體突變文庫。Cui等［55］通過NHEJ將多個大片段DNA引入解脂耶氏酵母基因組中，導致插入片段的染色體位置和基因拷貝數發生變化，自動生成了多樣化的基因表達文庫。與此同時，Bai等［57］建立了NHEJ介導的基因組文庫技術，允許隨機整合多個異源片段，從而產生了具有優異表型的不同菌株。Jang等［58］為了提高解脂耶氏酵母中HR的表達頻率及效率，阻斷了NHEJ通路中負責修復DSB的KU70基因，并使用羥基脲使細胞周期同步于S期。結果顯示，解脂耶氏酵母中同源重組HR頻率顯著提高（超過46%）。此外，Ding等［54］通過增加同源臂長度、下調/刪除KU70或KU80來抑制NHEJ以及異源表達來自釀酒酵母的ScRad52p，成功提高了解脂耶氏酵母的HR效率。Wagner等［59］使用26S rDNA或Zeta DNA位點和轉座子突變的多拷貝基因整合法成功拓展了解脂耶氏酵母的基因編輯方法庫。

重復的基因整合需要標記基因的循環使用。Gao等［60］通過回收兩側帶有兩個hisG位點的Ura3表達盒以及Cre-loxP系統能夠在含有5-氟硼酸的平板上進行多輪基因操作。Lv等［61-63］將Cre-loxP系統與靶向存在于解脂耶氏酵母基因組中至少200個拷貝中的26S rDNA相結合，可以實現重復的基因整合，而無需構建具有不同位點同源臂的質粒。Zhu等［64］基于此建立了一種基因多拷貝方法，可以替代傳統的多拷貝方法。通過增加基因整合到基因組的輪次來微調HpCrtW和HpCrtZ的轉錄表達，并同時應用HpCrtW和HpCrtZ的模塊化酶組裝。此外，Zhou等［65］基于Cre/loxP位點特異性重組系統開發出了一種新型高效的基因整合工具。其只需一個單一的選擇標記，可以完全切除所有不必要的序列，從而實現了在相同整合位點重復完成基因的整合操作。近期，一個由自主復制序列（ARS）、一個著絲粒（CEN）和兩個端粒元件（TEL）組成的解脂耶氏酵母人工染色體（ylAC）被開發出來，可用于多個基因表達盒的有效組裝。基于此結果，Guo等［66］將一個含有8個基因表達盒長23 kb的重組ylAC成功整合到了解脂耶氏酵母基因組中，結果使解脂耶氏酵母工程菌株能夠同時消耗利用木糖和纖維二糖。

2.4 CRISPR-Cas系統

2013年，CRISPR-Cas系統被首次成功應用于對酵母菌即釀酒酵母染色體基因組的修飾［67］。緊接著，該技術就在其他酵母底盤中如解脂耶氏酵母［68-69］、巴斯德畢赤酵母［70］、乳酸克魯維酵母［71］和粟酒裂殖酵母［72］等中實現了成功應用。其中，Schwartz等［68］將由混合RNA聚合酶III啟動子表達的gRNA和經密碼子優化的Cas9蛋白共轉化到解脂耶氏酵母宿主菌株中，結果顯示目標基因的敲除率達到了90%。Gao等［73］將gRNA表達盒和Cas9表達盒插入到同一質粒中，然后將該質粒分別轉化至解脂耶氏酵母野生型、ΔKU70菌株和ΔKU70/ΔKU80菌株中，結果顯示野生型菌株和ΔKU70/ΔKU80菌株中的基因定向編輯效率分別為85.6%和94.1%。Holkenbrink等［74］又構建了針對解脂耶氏酵母底盤的EasyCloneYAL1系統，單基因敲除率為90%，雙基因敲除率為6%-66%。Gao等［75］通過構建兩個整合型載體（各含1個Cas9表達盒和1個sgRNA表達盒），其效率約為20%。緊接著，該課題組又構建了含有1個Cas9表達盒和2個sgRNA表達盒的質粒，并將其與含有待敲入基因的質粒進行共轉化，基因同源重組整合效率為15%-37%。Larroude等［76］使用Golden Gate技術構建了一組用于編輯解脂耶氏酵母基因組的含有不同標記的CRISPR-Cas系統。此外，Schwartz等［77］開發出了一種可以對sgRNA在解脂耶氏酵母底盤中的切割效率進行定量的方法。

3 代謝工程改造解脂耶氏酵母合成PUFA的應用實例

解脂耶氏酵母作為代謝工程改造底盤細胞主要具有以下特征：（1）解脂耶氏酵母的安全級較高，能夠用于食品和醫藥的生產［78］。（2）該酵母是一種產油酵母，具備天然積累高含量脂質的能力，其脂質積累量可達細胞干重（dry cell weight, DCW）的40%以上，因此是生產游離脂肪酸、甘油三酯、生物柴油等脂質相關物質的理想宿主菌株。（3）該酵母對油脂類物質具有較強的分解能力［79］。（4）該酵母能夠在多種碳基質如親水性和疏水性廉價碳源上生長［80-81］，并通過特定代謝途徑將其轉化成各種高值化合物。（5）該酵母對各種不利生長條件的適應能力較強，例如可以在低pH和高滲透壓條件下生長，從而有利于減少細菌污染［82］。（6）該酵母不受葡萄糖效應的影響，因此不會進行有氧酒精發酵［83］。（7）該酵母具有完全測序的基因組和相對成熟的遺傳操作工具（如目前已開發了各種受體菌株和表達載體［81-84］），因此它已常被用作非模式微生物底盤/宿主菌來生產各種產品，成為了目前代謝工程和合成生物學方向使用最廣泛的非常規酵母底盤之一［81, 85］。

近年來，研究者紛紛嘗試利用代謝工程技術來改造解脂耶氏酵母底盤以生產PUFA。本文選擇了部分代表性成果進行介紹，具體包括，ω-3 PUFA：ALA、EPA和DHA；ω-6 PUFA：LA、GLA和ARA。

3.1 ω-3系列脂肪酸

Damude等將來自串珠鐮刀菌（Fusarium moniliformis）的Δ15-去飽和酶引入解脂耶氏酵母中進行表達，結果顯示該酶具有將內源LA一步轉化生成ALA的能力（圖1），ALA的積累量達到了總脂肪酸（total fatty acids, TFA）的20%以上［86］。為了進一步提高ALA的產量，Cordova等［87］選擇了高效積累油酸（占TFA 80%）的解脂耶氏酵母菌株作為出發底盤，并表達了圓紅冬孢酵母（R. kratochvilovae）Δ15-去飽和酶；因為該出發底盤能夠提供更多的前體物質——油酸，工程菌株中ALA含量得以提高。Tezaki等［88］通過驗證解脂耶氏酵母細胞膜磷脂層的脂肪酸組成證明了PUFA合成量與細胞膜流動性之間具有一定的正關聯性；而在低溫條件下，解脂耶氏酵母細胞可通過提高其胞內脂肪酸的不飽和度來維持其細胞膜的流動性。因此，研究者將工程菌株在20℃下對該工程菌株進行培養，ALA含量顯著增加，達到了TFA的近30%。通過補料分批發酵，解脂耶氏酵母工程菌株最終產生了1.4 g/L的ALA，這是目前酵母底盤生產ALA的最高產量。Li等［89］將可異源生產ALA的解脂耶氏酵母工程菌株與可利用木糖生長的解脂耶氏酵母工程菌株進行雜交，產生的子一代可以發酵木糖產生1.42 g/L的ALA。這一結果首次展示了利用菌株雜交的方式實現酵母發酵木糖生產PUFA的可能性。

迄今為止，由美國杜邦公司使用代謝工程策略改造解脂耶氏酵母生產EPA獲得的產量是目前微生物細胞工廠里的最高值［24,90］。首先，研究者對所保存的40株解脂耶氏酵母菌株進行了篩選發現，最適產脂菌株ATCC 20362的油脂產量超過了100 g/L，脂質生產率超過1 g/L/h。其次，將三拷貝的Δ12-去飽和酶、兩拷貝的Δ6-去飽和酶、四拷貝的C18/20-延長酶、五拷貝的Δ5-去飽和酶和三拷貝的Δ17-去飽和酶轉化至該菌株中，使其能夠通過Δ6途徑成功產生了EPA（占TFA 3%）（圖1）。緊接著，研究者又通過異源基因篩選、強啟動子、多拷貝整合等策略實現了去飽和酶和延長酶活性的增加。最終，工程菌株共攜帶有19個過表達的異源基因，發酵后其EPA產量高達TFA的40%［91-93］。

Gemperlein等［94］在解脂耶氏酵母底盤中異源表達了原核來源的PUFA合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGC），并成功實現了DHA的異源合成。研究人員將來源于黏細菌的聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）樣PUFA合成酶以及來源于束狀芽孢桿菌的DPA/DHA型PUFA合成酶轉化至解脂耶氏酵母底盤中，由此得到的工程菌株所產生的DHA產量為86.5 mg/L，占TFA的10.5%。為了進一步提高DHA的產量，研究人員比較了不同培養基組成及培養條件對PUFA生產菌株DHA產量的影響情況。結果表明，甘油對DHA生產菌合成DHA的促進作用最為顯著（例如，在甘油培養基中DHA產量可達到葡萄糖培養基的2倍）。此外，限制培養基中磷酸鹽緩沖液的含量對DHA生產也具有一定的正向影響。在葡萄糖和甘油培養基中，當使用2-嗎啉乙磺酸（4-morpholineethanesulfonic acid, MES）代替磷酸鹽緩沖液時，可觀察到DHA產量的顯著提高，最終通過代謝工程和發酵優化的組合使用可使DHA合成量達到100 mg/L，占TFA的16.6%。

3.2 ω-6系列脂肪酸

Sun等［95］將來自高山被孢霉的Δ6-去飽和酶引入到解脂耶氏酵母中，構建了一株能夠高產GLA的工程菌株（占TFA的4.6%）。同時，這項研究也證明了變溫策略可提高解脂耶氏酵母生產GLA的能力。通過28℃預培養和20℃移溫培養的策略對所獲得的工程菌株進行發酵優化，所得GLA產量為71.6 mg/L。

Zhang等［96］在解脂耶氏酵母中以高拷貝數表達了來自痤瘡丙酸桿菌的亞油酸異構酶，使其在能夠發酵葡萄糖產生反式-10，順式-12 CLA，產物含量達到了TFA的5.6%（DCW的0.23%），LA到CLA的底物轉化率達到了80%。Zhang等［97］進一步使用組合代謝工程策略培育出的解脂耶氏酵母工程菌株能夠產生高達TFA 10%（DCW 0.4%）的CLA，該菌株經發酵條件優化后能夠發酵大豆油培養基產生4 g/L的CLA（TFA的44%，DCW的30%）。本研究中使用的代謝工程策略包括：（1）使用改良的pHP4d啟動子（pHP4d啟動子與另外12個拷貝的UAS1B融合）共過表達亞油酸異構酶和Δ12-去飽和酶；（2）通過多拷貝整合質粒進一步增強這兩個異源基因的表達量，最終所構建的解脂耶氏酵母工程菌株是生產反式-10，順式-12 CLA的理想菌株。

Liu等［98］首次采用一步PCR法將核糖體RNA（ribosomal DNA，rDNA）作為整合位點對解脂耶氏酵母細胞進行了工程化改造，并證明了同源整合效率與rDNA重疊區長度有關。使用該方法將高山被孢霉來源的ARA完整生物合成途徑基因（近10 kb）快速組裝到了解脂耶氏酵母的染色體上，效率高達23%。所構建的工程菌株具有較高的遺傳穩定性，并能夠合成高水平的ARA（TFA的0.4%）。

表3列舉出了目前經代謝工程策略改造后的微生物底盤生產部分PUFA的最高產量及占總脂肪酸含量，也證明了經代謝工程改造的解脂耶氏酵母工程菌株具有高產PUFA的顯著優勢。

表3 代謝工程改造微生物底盤生產部分多不飽和脂肪酸的產量情況Table 3 Representative examples of PUFA production by metabolically engineered microorganisms

4 總結與展望

PUFA因其具有優良的生理功能及營養價值，現已被作為高附加值生物活性物質廣泛添加到了功能性食品等各種產品中，近年來市場上對于PUFA的需求量和價格持續大幅度增加，因此急需解決現有生產瓶頸或發展新的生產路線。不論從生態環保、投產比，抑或是產業規模來看，利用微生物發酵生產PUFA的方法均具有很大優勢，這是一條經濟高效的PUFA綠色合成途徑。解脂耶氏酵母作為一種天然高產油脂及脂肪酸的產油酵母，具備相對成熟的分子遺傳體系和不斷完善的合成生物學元件，因此成為了利用代謝工程策略改造微生物生產PUFA的首選底盤細胞之一。目前的研究結果也表明，經代謝工程改造后的解脂耶氏酵母細胞工廠已經實現了多種PUFA的合成，并展現出了優良的PUFA生產能力，因此其應用價值與發展前景是極為廣闊的。

然而，由于對解脂耶氏酵母的基礎及應用研究起步較晚，再加上該酵母存在的一些固有特性，在一定程度上限制了該酵母底盤在代謝工程及合成生物學方面的應用。目前所獲得的PUFA產量還無法達到大規模工業化、效益化生產的要求，有以下幾個主要問題亟待突破：

（1）該酵母本身不含有可自主復制的游離質粒，因此在該酵母底盤中進行外源基因表達時，需要首先構建人工整合載體，操作煩瑣、工作量大。而且，雖然已經具有了多種解脂耶氏酵母表達系統可用的組成型和誘導型強啟動子，但是在終止子元件方面的研究還相對落后。因此為解脂耶氏酵母構建能夠穩定高效進行自主復制的游離型質粒，繼續篩選更優的合成生物學組件（主要是終止子），開發序列更短、性能更強的人工啟動子元件和人工終止子元件，都將是下一步工作的重點工作。

（2）目前仍然缺乏可對解脂耶氏酵母基因組中多個基因進行同時快速編輯的簡便高效、特異性強的方法。未來需要研究者們開發出更多適用于解脂耶氏酵母基因組編輯的創新工具和技術。

（3）NHEJ是該酵母完成DNA雙鏈斷裂修復的主要形式，因此該酵母胞內的非同源重組效率極高，導致基因定點敲除和敲入非常困難。利用CRISPRCas9介導的基因整合技術雖然能夠提高其同源重組的成功率，但現有技術仍未完全解決該酵母更傾向于進行非同源重組的問題。

（4）目前利用代謝工程技術在該底盤中所進行的遺傳操作還相對較少，所用改造策略也并不完善，所以需要對該底盤進行更廣泛的定向遺傳改造（包括途徑基因工程、啟動子工程、輔助因子工程、蛋白質工程、前體工程、細胞器工程、細胞毒性工程、動態控制工程等），使代謝流更多地流向PUFA的合成途徑，進而提高該非常規酵母細胞工廠生產PUFA的效率。

（5）我們推測PUFA在解脂耶氏酵母中可能發揮了某些重要功能，但目前有關這一問題的研究卻相對較少；而且，解脂耶氏酵母不飽和脂肪酸合成和積累的分子調控機制尚不清晰，因此還需要深入研究PUFA的具體功能以及外界條件對解脂耶氏酵母合成PUFA的代謝影響及其調控機制。只有明確了這些關鍵核心問題，才能有的放矢，最終實現PUFA在解脂耶氏酵母底盤細胞中的進一步增產。

（6）該酵母是嚴格需氧的非發酵酵母，只有在氧氣充足時才能達到最佳的生長和代謝狀態，這可能是利用該酵母在工業上大規模發酵生產PUFA潛在的制約因素。