半乳糖氧化酶的生物學(xué)改造研究進(jìn)展

夏光麗 曹娜 孫慧慧 趙玲 曹榮，3

（1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266404；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266237）

酶介導(dǎo)的催化反應(yīng)具有高效節(jié)能、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，此外，酶還具有化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性等特性，使其成為可持續(xù)催化劑應(yīng)用于許多合成轉(zhuǎn)化中。酶分子良好的催化活性、熱穩(wěn)定性和催化效率是其工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用的基礎(chǔ)，但天然酶往往存在一些缺陷，如催化活性低、穩(wěn)定性差等，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。因此，蛋白質(zhì)工程通過(guò)利用結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)和生物學(xué)手段，對(duì)酶分子進(jìn)行改造，以提升其催化性能。此外，固定化技術(shù)也可以提高酶的穩(wěn)定性并提高酶的重復(fù)使用率。因此，對(duì)天然酶進(jìn)行生物學(xué)改造的研究吸引了眾多學(xué)者的關(guān)注，本文在概述半乳糖氧化酶基本信息的基礎(chǔ)上，綜述半乳糖氧化酶改造的研究現(xiàn)狀，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和改造利用半乳糖氧化酶提供理論基礎(chǔ)和研究思路。

1 半乳糖氧化酶概述

半乳糖氧化酶（EC 1.1.3.9）是碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)中新建立的輔助活性（auxiliary activity，AA）AA5_2家族中的一種銅依賴性氧化酶，能夠催化多種醇（糖）的羥基氧化生成相應(yīng)的醛，具有廣泛的底物特異性。半乳糖氧化酶在催化糖反應(yīng)中表現(xiàn)出嚴(yán)格的區(qū)域選擇性，在沒(méi)有任何復(fù)雜有機(jī)輔因子的作用下僅針對(duì)D-半乳糖分子上的C6位羥基進(jìn)行氧化［1-2］（圖1），基于這一特性，半乳糖氧化酶已成功應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。在食品分析中，它可用于奶類產(chǎn)品和相關(guān)乳制品中的乳糖測(cè)定［3］；在造紙行業(yè)中，半乳糖氧化酶生成的醛衍生物可用于提高紙張的強(qiáng)度［4-5］；在香料工業(yè)中，半乳糖氧化酶催化長(zhǎng)鏈脂肪醇生成的醛可用于香料的合成［6］；在醫(yī)藥領(lǐng)域，半乳糖氧化酶可用于抗HIV藥物的合成［7］；在化學(xué)合成領(lǐng)域，其醛基產(chǎn)物可以進(jìn)一步氧化形成羧基，這種方法在合成藥物中間體、制備新型糖類以及核苷酸等產(chǎn)品中具有廣泛的應(yīng)用［8-10］。

圖1 半乳糖氧化酶的催化反應(yīng)Fig. 1 Catalytic reaction of galactose oxidase

1.1 半乳糖氧化酶來(lái)源

半乳糖氧化酶是一種含銅的細(xì)胞外氧化還原酶，能夠催化一系列羥基醇氧化成醛，并將氧氣還原為過(guò)氧化氫［11］。該酶最早于1959年由Cooper等［12］從真菌Polyporus circinatus中分離出來(lái)。第一個(gè)被克隆并測(cè)序的半乳糖氧化酶基因是從Dactylium dendroides中提取的gaoA基因［13］，其長(zhǎng)度為2 043 bp，編碼一個(gè)含680個(gè)氨基酸序列的蛋白質(zhì)［14］，該基因已在畢赤酵母［15］、大腸桿菌［16］以及其他真菌中異源表達(dá)。目前已報(bào)道的半乳糖氧化酶主要來(lái)自鐮刀菌屬，其中亞谷狀鐮刀菌是半乳糖氧化酶的主要生產(chǎn)者［14］。此外，也有其他真菌來(lái)源半乳糖氧化酶的報(bào)道，如Magnaporthe oryzae［17］、Neurospora tetrasperma［18］、Colletotrichum graminicola［19］等。關(guān)于細(xì)菌來(lái)源的半乳糖氧化酶，目前在核苷酸序列分析的基礎(chǔ)上已經(jīng)確定了半乳糖氧化酶是Stigmatella aurantiaca中fbfB基因的產(chǎn)物同源物［20］，該基因編碼一種參與子實(shí)體形成的蛋白質(zhì)，但是該蛋白質(zhì)產(chǎn)物尚未被表征，其cDNA也尚未被檢測(cè)到［21］。

1.2 半乳糖氧化酶結(jié)構(gòu)

目前已對(duì)多個(gè)來(lái)源的半乳糖氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制進(jìn)行了研究，其中包括來(lái)自Hypomyces rosellus、Fusarium sp.、F. graminearum等的8個(gè)晶體結(jié)構(gòu)（圖2）。其分子結(jié)構(gòu)可分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域，幾乎全部由β折疊和轉(zhuǎn)角構(gòu)成（以來(lái)源于H. rosellus的半乳糖氧化酶為例，PDB ID：1GOG，圖3）［22］。第一結(jié)構(gòu)域由1-155位的氨基酸組成，呈現(xiàn)三明治結(jié)構(gòu)，包含8個(gè)反向平行的β折疊，形成粗糙的八面體空間構(gòu)型。該結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)構(gòu)域通過(guò)一條有序的多肽鏈連接，第二結(jié)構(gòu)域由156-532位氨基酸組成，是最大的結(jié)構(gòu)域。其整體外形呈現(xiàn)七瓣花狀，每個(gè)花瓣由4個(gè)反向平行的β折疊組成，這種結(jié)構(gòu)在各種真核配體結(jié)合蛋白以及與半乳糖氧化酶密切相關(guān)的其他酶中也很常見(jiàn)［23］。在第二結(jié)構(gòu)域中，有3個(gè)與金屬銅離子相連的氨基酸殘基，分別是Tyr272、Tyr495和His496，它們共同構(gòu)成了半乳糖氧化酶的催化活性位點(diǎn)，而銅離子作為活性位點(diǎn)的中心嵌入在這一結(jié)構(gòu)域中［20,22］。此外，第二結(jié)構(gòu)域中還存在由Tyr272-Cys228形成的硫醚鍵，該鍵的交聯(lián)形成Tyr-Cys輔助因子，經(jīng)過(guò)可逆氧化反應(yīng)在蛋白質(zhì)中形成苯基自由基［24-25］。第三結(jié)構(gòu)域包含533-639位氨基酸殘基，由7個(gè)反向平行的β折疊構(gòu)成。在第三和第四個(gè)折疊之間存在一段包含572-590位氨基酸的不規(guī)則長(zhǎng)片，它從第三結(jié)構(gòu)域貫穿至第二結(jié)構(gòu)域中間，并提供了第4個(gè)與銅離子結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)His581［22］。

圖2 八種已報(bào)道的半乳糖氧化酶晶體結(jié)構(gòu)Fig. 2 Crystal structures of eight reported galactose oxidases

圖3 半乳糖氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)（以來(lái)源于F. graminearum的半乳糖氧化酶為例，PDB ID：1GOG）Fig. 3 Crystal structure of galactose oxidase（Taken the galactose oxidase from F. graminearum as the template, PDB ID：1GOG）

1.3 半乳糖氧化酶催化機(jī)理

半乳糖氧化酶催化氧化是由Cu（I）介導(dǎo)的雙電子氧化還原反應(yīng)［26］，研究表明，該酶的活性位點(diǎn)結(jié)合了兩個(gè)不同的單電子受體，即一個(gè)Cu（II）金屬中心和一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)自由基（Tyr*），形成一個(gè)金屬基配合物，作為一個(gè)雙電子氧化還原單元參與催化轉(zhuǎn)化過(guò)程。半乳糖氧化酶可以表現(xiàn)出與兩個(gè)單電子還原步驟相關(guān)的3種不同的氧化態(tài)：（1）完全氧化形式：由Cu2+和自由基（Tyr*）組成，作為醇底物的氧化還原活性形式；（2）半還原形式：具有催化活性，包含Cu2+和Tyr的形式；（3）還原形式：無(wú)催化活性，含有Cu+和Tyr，可以參與催化循環(huán)［27］。半乳糖氧化酶催化的氧化還原反應(yīng)可以分為兩步：第一步反應(yīng)是底物醇氧化為醛，同時(shí)酶活性中心處的Cu2+被還原成Cu+。第二步反應(yīng)是氧氣還原為過(guò)氧化氫，同時(shí)Cu+被氧化成Cu2+，恢復(fù)到催化循環(huán)的起始狀態(tài)［5］（圖4）。

圖4 半乳糖氧化酶氧化還原過(guò)程示意圖Fig. 4 Schematic diagram of galactose oxidase redox process

2 半乳糖氧化酶的分子生物學(xué)改造

天然半乳糖氧化酶往往存在穩(wěn)定性差、活性低的問(wèn)題，導(dǎo)致其催化效率低、缺乏商業(yè)價(jià)值，無(wú)法滿足工業(yè)化應(yīng)用的需求。因此，近年來(lái)，對(duì)半乳糖氧化酶進(jìn)行分子生物學(xué)改造以提高其工業(yè)應(yīng)用性能成為研究的熱點(diǎn)。研究人員采取了多種策略，包括定向進(jìn)化、半/理性設(shè)計(jì)和固定化等方法，對(duì)半乳糖氧化酶進(jìn)行了多方面的性能改造，為開(kāi)發(fā)具有優(yōu)良性能、適用于工業(yè)生產(chǎn)的半乳糖氧化酶奠定了基礎(chǔ)。

2.1 定向進(jìn)化

定向進(jìn)化是一種在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然進(jìn)化過(guò)程的方法，通過(guò)迭代有益突變實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)性能的飛躍，無(wú)需對(duì)其結(jié)構(gòu)信息和催化機(jī)制有深入了解，可用于產(chǎn)生具有特定性質(zhì)或功能的酶［28］。定向進(jìn)化的一般步驟是以天然存在的酶為起點(diǎn)，確定目標(biāo)酶的性質(zhì)或功能，通過(guò)隨機(jī)突變和DNA改組等技術(shù)構(gòu)建基因突變文庫(kù)，然后采用快速、高通量的篩選方法，最終確定最佳的突變菌株。與其他方法相比，定向進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)在于不需要對(duì)半乳糖氧化酶的結(jié)構(gòu)有很深入的了解，只需進(jìn)行大量篩選，最終可以獲得性能明顯提高的菌株［29］。

2.1.1 隨機(jī)突變 隨機(jī)突變是一種構(gòu)建基因突變文庫(kù)的常用方法，通過(guò)利用epPCR（error-prone polymerase chain reaction，epPCR）技術(shù)，在擴(kuò)增目標(biāo)片段時(shí)有意引入錯(cuò)配堿基實(shí)現(xiàn)對(duì)單一的DNA片段形成隨機(jī)突變，以獲得所需酶的期望性能。該技術(shù)最早于1985年提出，1993年發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可用于酶分子改造［30］，目前已廣泛應(yīng)用于定向進(jìn)化中。例如，Escalettes等［31］以來(lái)源于F. graminearum的半乳糖氧化酶突變體M3為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)具有對(duì)映選擇性的M3變體進(jìn)行隨機(jī)突變，優(yōu)化了對(duì)1-苯乙醇的催化活性。最終篩選得到突變體M3-5在與（R）-1-苯乙醇進(jìn)行固相試驗(yàn)時(shí)表現(xiàn)出良好的催化活性和高對(duì)映體選擇性。此外，Wilkinson等［32］對(duì)來(lái)源于Fusarium spp. NRRL 2903 的天然半乳糖氧化酶進(jìn)行了改造，以D-半乳糖和1-甲基-α-D-半乳糖為底物，獲得了活性提高的半乳糖氧化酶突變體。研究中采用epPCR構(gòu)建了單、雙、三突變體，其中C383S/Y436H對(duì)D-半乳糖的催化效率提高了5.3倍，C383S/V494A對(duì)1-甲基-α-D-半乳糖的催化效率提高了4.9倍。V494A和Y436H單獨(dú)對(duì)催化效率影響不大，但與C383S迭代后可以顯著提高催化效率，推測(cè)這兩個(gè)位點(diǎn)的突變引起了微妙的變化，影響了C383S變體的修飾活性部位。Delagrave等［33］采用隨機(jī)突變結(jié)合數(shù)字成像光譜和固相篩選相結(jié)合的方法，高效地篩選出具有活性的突變體。其中突變體8-1（C383S/Y436H/V494A）的催化效率提高了16倍，突變體7.5.1（C383S/Y436H/N318D/V477D/A626S/V494A）的催化效率提升了19倍，這是首次報(bào)道的活性提高的半乳糖氧化酶突變體。

2.1.2 DNA改組 DNA改組技術(shù)是一種通過(guò)隨機(jī)打亂目標(biāo)基因中的片段，并在DNA水平上重組這些片段形成新的基因的技術(shù)。該技術(shù)在酶定向進(jìn)化中發(fā)揮了重要作用，因?yàn)樗梢钥焖偕纱罅康幕蜃凅w，為尋找最佳性能的酶提供了更廣泛的選擇。例如，Sun等［34］利用epPCR和StEP（stagger extension process）重組技術(shù)對(duì)來(lái)源于F. graminearum的天然半乳糖氧化酶進(jìn)行改造，最終獲得了突變體A3.E7，其攜帶突變S10P/M70V/P136（沉默突變）/G195E/V494A/N535D。與野生型酶相比，該突變體的催化效率提高了1.7倍，蛋白表達(dá)量提高了18倍（達(dá)到10.8 mg/L）。該突變體不僅保留了野生型半乳糖氧化酶的活性和底物特異性，還具有更高的熱穩(wěn)定性和表達(dá)水平，這些特性有望促進(jìn)酶的進(jìn)一步進(jìn)化和應(yīng)用。

2.2 理性設(shè)計(jì)

理性設(shè)計(jì)要求全面了解蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，從而預(yù)測(cè)具有所需性質(zhì)的潛在突變體［30］。通過(guò)選擇對(duì)催化反應(yīng)起關(guān)鍵作用的位點(diǎn)，并使用基因改造技術(shù)，如定點(diǎn)突變、片段插入/刪除等手段進(jìn)行精確設(shè)計(jì)，以實(shí)現(xiàn)預(yù)期的效果。在第三次酶工程浪潮中，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)、分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等方法，可以快速、高效地改造和篩選生物催化劑［35-36］，甚至可以從頭設(shè)計(jì)不存在于自然界中的新酶［37］，或者對(duì)現(xiàn)有酶進(jìn)行改造以賦予其新的功能。

2.2.1 定點(diǎn)突變 為了評(píng)估活性位點(diǎn)上的氨基酸殘基如何促進(jìn)催化過(guò)程以及自由基的形成和穩(wěn)定，Baron等［38］對(duì)來(lái)源于Fusarium spp.的半乳糖氧化酶的活性位點(diǎn)W290、C228、Y272進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并成功在A. nidulans中表達(dá)。然而，突變體Y272F由于失去了赤道銅配體（Y272）而無(wú)法與銅結(jié)合，導(dǎo)致其難以被純化。野生型酶和突變體（W290H和C228G）已經(jīng)通過(guò)X射線晶體學(xué)和可見(jiàn)光譜進(jìn)行了表征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變體C228G和W290H的kcat/Km比野生型酶低近千倍，且更容易變性，這表明C228-Y272之間的硫醚鍵以及在該鍵上堆疊的W290對(duì)活性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。有研究者提出，軸向的Y495在半乳糖氧化酶催化機(jī)制的第一步中接受來(lái)自底物的質(zhì)子。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，Reynolds等［39］制備了半乳糖氧化酶GOase的突變體Y495F。動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，突變體的Km值與野生型酶相似，但kcat/Km降低了1 100倍；可見(jiàn)吸收光譜顯示，突變體在410 nm和810 nm處的消光系數(shù)分別降低了4倍，這一結(jié)果有力地支持了Y495是野生型酶催化反應(yīng)中攝取質(zhì)子的重要堿基。類似地，Baron等［40］為了研究半乳糖氧化酶中氧化還原活性位點(diǎn)W290和C228在催化機(jī)制中的作用，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)誘變，得到了突變體W290H和C228G。將這兩個(gè)突變體的晶體結(jié)構(gòu)與野生型的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析，并測(cè)定它們的活性，結(jié)果顯示突變體的晶體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯變化，但其活性比野生型酶低近千倍，證實(shí)了C228和W290在酶催化過(guò)程中的關(guān)鍵作用。AA5_2亞家族中的部分酶不能氧化半乳糖和半乳糖苷，但能有效地催化多種脂肪醇的氧化。基于此，Koncitikova等［41］選取了來(lái)自C. graminicola（CgrAlcOx）的醇氧化酶和來(lái)自F. graminearum（FgrGalOx）的半乳糖氧化酶，通過(guò)定點(diǎn)誘變的方式探究了AA5_2亞家族中驅(qū)動(dòng)醇氧化酶和半乳糖氧化酶之間底物偏好性的關(guān)鍵氨基酸殘基，產(chǎn)生并表征了多個(gè)醇氧化酶變體。與半乳糖氧化酶相比，醇氧化酶突變體M4F（W39F/F138W/M173R/T246Q）和M6（W39F/F138W/M173R/F174Y/T246Q/L302P）對(duì)碳水化合物表現(xiàn)出相似的親和力，其中CgrAlcOx-M4F對(duì)D-半乳糖的Km值比FgrGalOx高5倍，CgrAlcOx-M6變體表現(xiàn)出對(duì)D-半乳糖的最佳親和力，其Km值與FgrGalOx的Km值相似。從而鑒定了活性位點(diǎn)附近的6個(gè)殘基W39、F138、M173、F174、T246、L302對(duì)底物識(shí)別至關(guān)重要。

2.2.2 片段插入/刪除 Mathieu等［15］在蛋白質(zhì)一級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下，對(duì)來(lái)自C. graminicola 的醇氧化酶CgrAAO的活性位點(diǎn)進(jìn)行了研究。他們通過(guò)截短活性位點(diǎn)中的一個(gè)獨(dú)特的loop環(huán)，探究其對(duì)催化活性的影響。突變體CgrAAO-Δloop由于環(huán)的缺失顯著降低了酶對(duì)低聚半乳糖C6位羥基的固有活性，但獲得了C1位的氧化活性。與野生型酶相比，突變體CgrAAO-Δloop更傾向于將大多數(shù)被測(cè)試的碳水化合物（如乳糖、半乳糖、木糖、葡萄糖、蜜二糖等）的C1位優(yōu)先氧化，生成相應(yīng)的糖醛酸，但其對(duì)半乳糖的催化效率相對(duì)于野生型酶略有降低。值得注意的是，突變體CgrAAO-Δloop獲得了對(duì)D-葡萄糖和麥芽糖的催化活性。這種C1位的區(qū)域特異性在AA5酶家族中前所未有，為改進(jìn)生物催化劑的各種潛在應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.3 半理性設(shè)計(jì)

半理性設(shè)計(jì)是一種在不完全了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能信息的情況下進(jìn)行基因改造的方法。它結(jié)合了定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)，既確定了基因改造的方向，同時(shí)又降低了篩選的工作量［42］。盡管半理性設(shè)計(jì)通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)在一定程度上克服了篩選的限制，但仍需要建立“小而精”的突變體文庫(kù)，其經(jīng)典方法是位點(diǎn)飽和突變［43］。例如，Sun等［44］對(duì)半乳糖氧化酶進(jìn)行了修飾，引入了葡萄糖氧化酶的活性。研究中利用比野生型表達(dá)更好、更穩(wěn)定的突變體A3.E7作為模板，通過(guò)組合飽和突變，得到了葡萄糖氧化酶M-RQW（R330K/Q406T/W290F）。該突變體具有區(qū)域選擇性，僅對(duì)D-葡萄糖的C6-OH基團(tuán)起作用，在自然界中尚未觀察到D-葡萄糖在C6-OH位置的氧化。與A3.E7相比，M-RQW對(duì)D-葡萄糖的活性增加了100倍，酶活性水平為1.6 U/mg。Deacon等［45］通過(guò)在成熟半乳糖氧化酶序列中引入沉默突變，增強(qiáng)了酶的翻譯，并在優(yōu)化了半乳糖氧化酶表達(dá)條件（包括大腸桿菌宿主菌株、自誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、培養(yǎng)時(shí)間和細(xì)胞裂解程序）的基礎(chǔ)上，對(duì)影響底物結(jié)合的殘基C383進(jìn)行了飽和突變文庫(kù)的構(gòu)建。通過(guò)蛋白質(zhì)純化和初步表征發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)突變體的酶活性水平高于野生型半乳糖氧化酶，但也有一部分突變體的催化效率遠(yuǎn)低于野生型酶。這個(gè)基于大腸桿菌的高效表達(dá)系統(tǒng)為突變文庫(kù)的分析提供了良好的基礎(chǔ)，并對(duì)未來(lái)的定向進(jìn)化研究具有重要意義。

2.4 固定化

針對(duì)游離酶存在的穩(wěn)定性差、分離純化困難以及重復(fù)使用率低等問(wèn)題，酶的固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。固定化可以將酶分子固定在載體上，同時(shí)允許底物和產(chǎn)物自由進(jìn)出［3,31］。酶的固定化有多種方法，不同的固定化方式會(huì)使酶具有不同的性能。目前常見(jiàn)的固定化方法包括物理吸附法、包埋法、交聯(lián)法、結(jié)合法以及新型的固定化技術(shù)，每種方法都存在一定的優(yōu)勢(shì)和不足。

2.4.1 物理吸附法 物理吸附法是利用酶和載體之間的物理相互作用力（如氫鍵、范德華力、疏水作用力等），將酶固定在載體表面的一種固定化方法［46］。該方法具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、載體價(jià)廉易得、可反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)［47］。然而，由于酶與載體之間的相互作用力較弱，使得酶容易從載體上脫離，因此穩(wěn)定性較差［46］。

近年來(lái)，一些研究者利用Langmuir-Blodgett（LB）膜吸附在固體載體上的脂質(zhì)基質(zhì)作為載體用于酶的固定化，并能保留酶的活性［48］。例如，de Souza Furtado等［49］將半乳糖氧化酶與脂質(zhì)基質(zhì)結(jié)合后，將濃縮的酶脂質(zhì)單層轉(zhuǎn)移到LB膜的固體載體上制備固定化酶。酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與游離酶相比，固定化酶在30 d后表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性，這表明超薄膜可以幫助維持固定化酶的催化活性，同時(shí)為納米技術(shù)和生物傳感制造提供了可能性。

2.4.2 包埋法 包埋法是一種將酶或細(xì)胞包埋在多孔載體（如海藻酸鈉、瓊脂糖、明膠等）內(nèi)部發(fā)生聚合、沉淀或凝膠化使之固定化的方法。包埋法工藝簡(jiǎn)便，酶活回收率高，但是對(duì)載體要求較高［45,50］。同時(shí)該方法反應(yīng)條件溫和，一般不會(huì)改變酶的結(jié)構(gòu)，但酶與載體之間的相互作用力也較弱，容易出現(xiàn)脫落現(xiàn)象［51］。研究人員已經(jīng)對(duì)包埋法進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn)。例如，Akbaari Gourdani等［52］制備了一種用于鏈接反應(yīng)的非均相酶體系，利用包埋技術(shù)將半乳糖氧化酶固定在藻酸鈣珠中，合成海藻酸多糖珠（GOBead），并通過(guò)優(yōu)化珠粒尺寸和酶與藻酸鈉的比例，以獲得最高的酶活性。結(jié)果表明，GO-Bead可以回收并在多次運(yùn)行中有效地重復(fù)使用，但與游離酶相比其催化活性略有損失。

2.4.3 交聯(lián)法 交聯(lián)法是利用一些雙功能試劑，如戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2,2-二磺酸等，與酶分子之間進(jìn)行交聯(lián)形成共價(jià)鍵，從而得到三維的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的固定化方法。除了酶分子之間形成交聯(lián)外，還存在著分子內(nèi)交聯(lián)［51］。將生物分子附著在涂有連接層的金屬表面上是一種保持其天然生物活性的方法。Kaminska等［53］使用反式二苯乙烯（4,4'-二異硫氰酸酯）-2,2'-二磺酸（DIDS）作為交聯(lián)劑，將半乳糖氧化酶固定在Ag和Au表面的硫醇自組裝單層上，提供了一種制造酶電極的潛在方法。DIDS是一種對(duì)稱的雙功能試劑，可以與硫醇的胺部分和酶的伯氨基反應(yīng)。該研究利用表面增強(qiáng)拉曼光譜和表面等離子體共振技術(shù)研究了固定化后的半乳糖氧化酶。實(shí)驗(yàn)表明，使用DIDS的Au電極修飾的半胱胺產(chǎn)生了約8.4×107g/cm2的表面覆蓋率，而僅使用半胱胺修飾的Au基底僅產(chǎn)生了約1.2×107g/cm2的表面覆蓋率。結(jié)果證明，在不損失半乳糖氧化酶催化活性的前提下用該方法固定化的半乳糖氧化酶層非常穩(wěn)定，不會(huì)被緩沖溶液輕易地從表面去除。

2.4.4 結(jié)合法 共價(jià)結(jié)合法是一種常見(jiàn)的固定化酶的方法，通過(guò)共價(jià)鍵連接載體和酶蛋白分子。但是該方法需要先對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)改性，引入可反應(yīng)的官能團(tuán)，例如氨基、羥基、醛基等［45］。當(dāng)載體表面的官能團(tuán)與酶蛋白分子上的可反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)后，就可以形成牢固的共價(jià)鍵連接。這種方法所得的復(fù)合酶與載體之間的連接穩(wěn)定性高，使得酶不易從載體上脫落，可以重復(fù)使用。然而，共價(jià)結(jié)合反應(yīng)往往比較劇烈，可能導(dǎo)致酶蛋白分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響酶的活性，因此需要注意反應(yīng)條件的控制［54-55］。

Mattey等［56］通過(guò)共價(jià)連接半乳糖氧化酶變體M1、M3-5、工程膽堿氧化酶和單胺氧化酶于固體載體上，成功制備了固定化酶生物催化劑。這些固定化酶表現(xiàn)出長(zhǎng)期穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性，在穩(wěn)定性（超過(guò)20倍）、60℃的耐熱性以及對(duì)純有機(jī)溶劑如己烷和甲苯的耐受性方面優(yōu)于它們的游離對(duì)應(yīng)物。這些非均相氧化催化劑可以回收并多次重復(fù)用于不同底物的氧化。?evik等［57］利用半乳糖氧化酶構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的生物傳感器，用于檢測(cè)半乳糖。該生物傳感器將半乳糖氧化酶共價(jià)連接在聚甲基丙烯酸縮水甘油酯-乙烯基二茂鐵膜上，并研究了生物傳感器的制備和操作的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。該生物傳感器響應(yīng)快、價(jià)格低廉，并表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性、靈敏度及檢測(cè)限等性能。Kondakova等［58］將來(lái)自禾谷鐮刀菌IMV-1060的半乳糖氧化酶吸附在改性的二氧化硅載體上并共價(jià)連接，制備了固定化酶，成功用于D-半乳糖和含半乳糖的復(fù)雜混合物的分析測(cè)定。

2.5 新型固定化技術(shù)

傳統(tǒng)的固定化技術(shù)存在一些缺陷，如固定化酶活性降低和傳質(zhì)受阻等問(wèn)題，因此新型的固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［59］。隨著材料仿生學(xué)的不斷研究，出現(xiàn)了一種新的固定化方法——仿生礦化。秦瓊［4］利用金屬離子（Cu2+）和無(wú)機(jī)鹽形成金屬無(wú)機(jī)結(jié)構(gòu)核心，從而與半乳糖氧化酶（GAO）雜交結(jié)合，形成一種蛋白-金屬無(wú)機(jī)雜交結(jié)構(gòu)。考慮到GAO催化底物會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，因此引入過(guò)氧化氫酶來(lái)去除過(guò)氧化氫，而產(chǎn)生的氧氣又可以提供給GAO的催化反應(yīng)。研究者將GAO與過(guò)氧化氫酶按照一定比例共同礦化固定到磷酸銅載體中，成功礦化后，得到的復(fù)合結(jié)構(gòu)產(chǎn)物不僅具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而且催化活性和溫度耐受性都得到了顯著提升。此外，Chen等［60］使用NECu（II）和Zr（IV）包封半乳糖氧化酶（GO），成功制備了GO無(wú)機(jī)納米花。在NECu（II）和Zr（IV）的協(xié)同催化下，副產(chǎn)物H2O2分解生成·OH和O2。固定化的GO在10 h內(nèi)實(shí)現(xiàn)了98.1%的5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)化率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離GO（22.2%）的轉(zhuǎn)化率。

3 總結(jié)與展望

近年來(lái)，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)半乳糖氧化酶進(jìn)行改造的研究取得了快速的發(fā)展，改造后的酶具有使用方便、活性高等一系列優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。本文總結(jié)了半乳糖氧化酶生物學(xué)改造的最新研究進(jìn)展，包括定向進(jìn)化、半/理性設(shè)計(jì)和固定化技術(shù)等。這些技術(shù)的推廣和不斷改進(jìn)已顯著提高了酶的性能，使其更加適用于生產(chǎn)和應(yīng)用。未來(lái)的研究將繼續(xù)深入挖掘半乳糖氧化酶改造的潛力，有以下幾個(gè)關(guān)鍵方向值得關(guān)注：（1）結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理的深入研究。研究人員可以借助分子動(dòng)力學(xué)和分子模擬等高級(jí)技術(shù)，更深入地研究半乳糖氧化酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理。通過(guò)解析酶的原子級(jí)別結(jié)構(gòu)以及催化底物的交互方式，揭示更多有關(guān)其活性中心和底物特異性的信息，這將為設(shè)計(jì)更高效的改造策略提供重要的指導(dǎo)。（2）新領(lǐng)域的應(yīng)用探索。盡管半乳糖氧化酶的催化功能正在不斷被發(fā)掘，但在這些酶的系統(tǒng)發(fā)育多樣性中決定催化功能差異的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征仍然是未知的。以往的研究集中在改變生物酶的立體構(gòu)象以增強(qiáng)其催化活性和穩(wěn)定性，而對(duì)酶催化功能多樣性的研究知之甚微。最近的研究揭示了AA5_2亞家族的部分半乳糖氧化酶除了能催化部分含羥基的底物生成醛基產(chǎn)物外，還可將該醛基產(chǎn)物進(jìn)一步氧化生成羧酸類物質(zhì)，該物質(zhì)在合成藥物中間體、制備新型糖類產(chǎn)品以及核苷酸產(chǎn)品中具有重要的作用。研究人員可以繼續(xù)探索這些新領(lǐng)域，并尋求創(chuàng)新的方法，以充分發(fā)揮半乳糖氧化酶的催化作用。這將有助于滿足不斷增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，同時(shí)促進(jìn)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。（3）提升和創(chuàng)新改造技術(shù)。研究人員還可以進(jìn)一步探索新型酶工程方法，如基因編輯和蛋白工程，以創(chuàng)造具有特定催化性能的新型半乳糖氧化酶，這將為更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域帶來(lái)新的機(jī)會(huì)。這些研究將有助于更好地利用半乳糖氧化酶的催化作用，推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。