外源鈣緩解小麥幼苗鹽脅迫的作用機制

焦進蘭 王文文 介欣芮 王華忠 岳潔瑜

（天津師范大學生命科學學院 天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

小麥作為第二大糧食作物，約占我國居民口糧消費總量的43%，在糧食安全中占有重要的地位。然而，小麥在生長發育過程中經常受到各種逆境脅迫而導致減產，鹽脅迫就是其中之一［1］。近年來，土壤鹽漬化問題在世界范圍內廣泛存在且日趨嚴重，提高鹽漬化土地內糧食作物的耐性已迫在眉睫。鹽脅迫會引起離子毒害、滲透脅迫、氧化損傷等［2］。滲透和離子脅迫會導致葉片生長緩慢并導致葉片過早衰老，從而導致植物光合作用受到抑制［3］。此外，鹽脅迫下，植物細胞產生過量的活性氧（reactive oxygen species, ROS）破壞細胞組分，導致氧化損傷，損傷嚴重時，甚至導致植株死亡［4］。因此，解析小麥耐鹽機制具有重要的現實意義。

植物在受到外界脅迫時，其自身會發生一系列反應來抵御脅迫，包括活性氧清除與降解、細胞凋亡與自噬等［5-6］。自噬是真核細胞內一種進化保守的自我消化機制，是負責將受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白及其他大分子物質等運送至液泡（植物）或溶酶體（動物）降解并再利用的過程［7］。已有研究表明，自噬是鹽脅迫下植物細胞維持細胞穩態的主要途徑之一。正常水平的自噬是一種通過降解細胞內異常組分以維持細胞穩態的過程，但自噬過度上調則會引起自噬性細胞死亡（autophagic cell death），即II型細胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）［8］。對植株來說，適度的細胞自噬可為其他細胞提供所需營養物質，幫助其他細胞維持正常的生理機能，或者用來修復逆境脅迫所帶來的傷害等［9］。在煙草、擬南芥、水稻、小麥等植物上自噬相關基因（autophagy related gene, ATG）的鑒定和分析相繼被報道，揭示自噬在植物應答逆境脅迫過程中發揮非常關鍵的作用，ROS的產生是植株抵御脅迫共有的關鍵過程［10-11］。但關于自噬與自噬性細胞死亡之間的相互轉換關系，相關的調控信號途徑等問題尚不清晰。

鈣離子（Ca2+）作為植物體內的第二信使，在植物的生長發育和響應逆境脅迫中發揮重要的作用。非生物脅迫下，外源Ca2+的施用可改善脅迫環境對細胞生長發育的抑制，維持細胞功能和結構的完整性［12］。如CaCl2處理通過改善細胞膜的結構完整性來限制梨上褐斑的發展［13］。外源Ca2+處理增加了西蘭花微綠葉菜的生物量，并延緩了其衰老［14］。在鹽脅迫條件下，Ca2+誘導Ca2+通道阻礙Na+的吸收，維持植物的生長，同時還作為一種信號分子參與鹽脅迫信號轉導，調節相關基因的表達，從而提高植物耐鹽性［15］。Ca2+通過降低植物根系對Na+的吸收量和向地上部的運輸量，增加對K+、Mg2+、Ca2+的吸收量和運輸量，降低鹽脅迫下各器官Na+/Ca2+值、Na+/K+值［16］。在植物體內，Ca2+主要通過Ca2+信號感受蛋白傳遞脅迫信號，如鈣調素（calmodulins,CaM）、鈣依賴蛋白激酶（Ca2+-dependent protein kinases, CDPK）等，這些Ca2+感受器被復雜的基因家族編碼，構成了復雜的信號傳遞網絡［17］。當植物處于鹽脅迫環境中，Ca2+通道蛋白作為重要的鹽信號受體能迅速感知并使胞內Ca2+濃度急劇上升［18］。CDPK可直接被Ca2+信號激活，通過感知Ca2+濃度的變化向下游傳遞信號，誘導下游基因的表達，從而改變植株的理化性質，同時調節細胞自噬與凋亡，使植物對逆境脅迫進行適應和抵御［19］。研究表明，OsCPK12可以通過減少水稻ROS的積累來增加對脫落酸（abscisic acid, ABA）的敏感性并提高植株的耐鹽性［20］。過表達VaCDPK20提高了擬南芥在冷凍和干旱處理條件下的耐性［21］。已有研究表明Ca2+信號對自噬發生過程的重要調控作用［22］。在一些生理和病理條件下，Ca2+誘導哺乳動物細胞自噬增加［23］。外源Ca2+通過提高梨的自噬活性和水楊酸水平，提高梨對多刺葡萄孢菌的抗性［24］。

Ca2+作為一種幫助植物更好適應鹽脅迫的效應分子，目前，其對植物耐鹽性調控作用的研究主要集中在生理學研究，Ca2+調控植物耐鹽的作用機制還需要進一步研究。

本研究以河農6425品種小麥為材料，解析Ca2+在小麥幼苗響應鹽脅迫中的作用及Ca2+在鹽脅迫誘導的自噬中的調控作用，為進一步揭示植物鹽脅迫應答機制提供分子證據。

1 材料與方法

1.1 材料

以小麥品種河農6425作為試驗材料，該品種屬于中早熟冬性小麥，生育期為249 d，有較強的抗倒伏性。在小麥生長至苗期的兩葉一心時，對其進行處理。用150 mmol/L NaCl處理以創造小麥幼苗鹽脅迫環境，NaCl處理濃度以50 mmol/L逐天遞增至150 mmol/L，每天NaCl遞增的濃度為50 mmol/L。以避免鹽激效應對小麥幼苗生長造成影響。以CaCl2和LaCl3分別作為外源Ca2+和Ca2+抑制劑，對小麥幼苗進行處理。

1.2 方法

1.2.1 Ca2+及其抑制劑的濃度篩選 選取顆粒飽滿、大小均勻的小麥種子，用蒸餾水浸種24 h，置于鋪有兩層紗布的培養盆中培養，期間定時澆水以確保種子能正常發芽生長。待小麥幼苗生長至一葉一心期，將其轉移至1/10 Hoagland營養液中繼續培養（表1）［1］，至兩葉一心期時，選取生長一致的小麥幼苗進行Ca2+及其抑制劑處理。設置0、1、5、10和20 mmol/L CaCl2濃度梯度，分別對正常生長小麥幼苗和鹽脅迫小麥幼苗進行處理。基于前期試驗，選用5 mmol/L LaCl3作為Ca2+抑制劑對正常生長小麥幼苗和鹽脅迫小麥幼苗進行處理。

表1 營養液配置表Table 1 Nutrient solution formula

1.2.2 小麥幼苗形態觀察及生長參數測定 觀察小麥幼苗生長狀況，待不同處理組小麥幼苗形態有明顯差異時，用直尺測量小麥幼苗根長、葉長、葉寬、株高等生長參數，每組至少測量5株，并對不同處理組小麥幼苗進行取樣拍照［1］。

1.2.3 葉綠素熒光參數測定 使用雙通道調制葉綠素熒光儀測量不同處理組中小麥幼苗第三葉的葉綠素熒光參數，每組至少測量5株。葉片暗適應20 min后測量暗適應后的最小熒光值F0、光系統II（photosystem II, PSII）的最大光化學效率Fv/Fm、PSII的實際光能轉化效率Y（II）、光合電子相對傳遞速率ETR、光化學淬滅值qP及非光化學淬滅值NPQ［1］。

1.2.4 二氨基聯苯胺（diaminobenzidine, DAB）染色 參考實驗室之前建立的方法［1］。取小麥幼苗第三葉葉片3-4 cm，去掉發黃葉尖，每組至少3個重復，置于1 mg/mL DAB染液中，抽真空20 min后，25℃避光染色13 h，然后，將葉片放進卡諾試劑（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1）固定7 h。85%酒精60℃水浴脫色，直至葉片無色后放進葉保存液（75%乙醇+5%甘油+ddH2O）中4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于1 mg/mL DAB染液，25℃避光染色30 min，用ddH2O沖洗染液，結束染色，將其放進根保存液（50%乙醇+5%甘油+ddH2O）4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2, 日本）觀察拍照。

1.2.5 氯化硝基四氮唑藍（nitrotetrazolium blue chloride, NBT）染色 方法同1.2.4，將材料置于0.5 mg/mL NBT染液中，抽真空20 min，25℃避光染色10 h，置于卡諾試劑固定7 h，85%酒精60℃水浴脫色，至葉片無色，置于葉保存液，4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于0.5 mg/mL NBT染液25℃避光染色5-8 min，用ddH2O將染液沖洗干凈，并置于根保存液，4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2，日本）觀察拍照。

1.2.6 伊文思藍染色 方法同1.2.4，將材料置于0.25%伊文思藍染液25℃避光染色24 h，用ddH2O沖洗，放進煮沸的脫色液（無水乙醇∶甘油=9∶1）水浴脫色，至葉片底色變為白色，置于葉保存液4℃保存。取小麥幼苗根尖1-2 cm置于0.25%伊文思藍染液中，25℃避光染色5-10 min，用ddH2O快速沖洗，并靜置1 h去掉浮色后放進根保存液中4℃保存。用體式顯微鏡（Nikon C-fled2，日本）觀察拍照。

1.2.7 過氧化物酶（peroxidase, POD）活性檢測 采用POD活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中POD活力，參考過氧化氫氧化法，使用紫外分光光度計（UVmini-1240, 島津）測定反應混合液在470 nm處的吸光值，計算POD活力。3次重復試驗。

1.2.8 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性檢測 采用SOD活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中SOD活力，參考還原氮藍四唑法，用紫外分光光度計測定反應混合液在560 nm處的吸光值，計算得出SOD活力。3次重復試驗。

1.2.9 過氧化氫酶（catalase, CAT）活性檢測 采用CAT活性檢測試劑盒測定小麥幼苗中CAT活性，用紫外分光光度計測定反應混合液在240 nm處的吸光值，計算得出CAT活力。3次重復試驗。

1.2.10 超氧陰離子（O2·-）含量檢測 采用O2·-含量檢測試劑盒測定小麥幼苗中O·-含量，利用O·-22與鹽酸羥胺反應生成NO2-，NO2-在對氨基苯磺酰胺和萘乙二胺鹽酸鹽的作用下，生成紫紅色的偶氮化合物，在530 nm有特征吸收峰，通過酶標儀（Infinite M200 Pro，瑞士）測定A530即可計算得出O2·-含量。3次重復試驗。

1.2.11 過氧化氫（H2O2）含量檢測 采用H2O2含量檢測試劑盒檢測小麥幼苗中H2O2含量，利用酶標儀（Infinite M200 Pro，瑞士）測定反應混合液在波長415 nm處的吸光值，計算H2O2含量。3次重復試驗。

1.2.12 葉綠素含量測定 采用95%乙醇提取法測定小麥幼苗中葉綠素含量［25］。稱取小麥幼苗第三葉葉片0.2 g，加液氮研磨后放入10 mL離心管中，加入8 mL 95%乙醇于25℃避光放置12 h以充分提取葉綠素，之后4 500 r/min離心10 min，取上清，用紫外分光光度計分別測定波長663和645 nm時的吸光值，計算葉綠素含量。3次重復試驗。

1.2.13 TUNEL染色檢測小麥幼苗凋亡細胞 采用DeadEndTMFluorometric TUNEL System（Promega，美國）試劑盒檢測小麥幼苗中凋亡細胞，分別用DAPI和PI染液對小麥幼苗葉片和根部組織進行復染后，使用正置熒光顯微鏡觀察植物組織中細胞凋亡情況，并拍照進行計數統計。

1.2.14 MDC（monodansylcadaverine）染色檢測小麥幼苗自噬活性 運用MDC染色檢測小麥幼苗自噬活性［26］。取小麥幼苗根和葉片1-2 cm，蒸餾水洗凈，浸沒于染色液中，抽真空15 min后置于冰上黑暗染色30 min，用1×PBS清洗多余染色液結束染色。用共聚焦顯微鏡觀察植物組織中自噬活性變化。

1.2.15 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測 運用RT-qPCR檢測小麥幼苗中各基因的表達量［6］，提取小麥幼苗組織RNA，并反轉錄為cDNA，PCR擴增程序為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環，以Tublin作為內參基因進行數據分析。各處理組進行3次重復試驗。所用引物如表2。

表2 RT-qPCR引物Table 2 Primers used for RT-qPCR

2 結果

2.1 Ca2+緩解NaCl脅迫下小麥幼苗生長的濃度篩選

外源施加不同濃度CaCl2處理144 h后，與NaCl處理組相比，1、5、10和20 mmol/L CaCl2處理均顯著提高小麥幼苗的耐鹽性，其根長和葉寬均顯著增加（圖1-A-B）。其中10 mmol/L CaCl2處理緩解小麥幼苗耐鹽性的效果最顯著，根長、葉寬均顯著增多，小麥幼苗長勢最好（圖1-C-D）。

圖1 不同濃度CaCl2對NaCl脅迫下小麥幼苗生長影響Fig. 1 Effects of different concentrations of CaCl2 on wheat seedling growth under NaCl stress

為了探究不同濃度CaCl2處理對小麥幼苗葉片組織中ROS的影響，分別用DAB和NBT染色檢測H2O2和O2·-在小麥葉片中的累積情況。NaCl脅迫導致葉片組織中H2O2和O2·-積累量增多。不同濃度CaCl2處理后，NaCl脅迫導致的H2O2和O2·-積累量均有所減少，其中10 mmol/L CaCl2處理組中H2O2和O2·-積累量最少（圖2-A-B）。

圖2 NaCl脅迫對小麥幼苗葉片生長機理影響Fig. 2 Effects of NaCl stress on the growth mechanism of wheat seedling leaves

采用伊文思藍染色法探究不同濃度CaCl2對小麥幼苗葉片細胞活力的影響。NaCl脅迫會導致葉片中死亡細胞增多，使細胞活力降低，分別添加1、5、10和20 mmol/L CaCl2處理后，葉片死亡細胞減少，其中，施加10 mmol/L CaCl2后，死亡細胞最少，葉片細胞活力最高（圖2-C）。

綜上，外源施加CaCl2對NaCl脅迫下小麥幼苗生長有促進作用，10 mmol/L CaCl2對NaCl脅迫的緩解效果最好。因此，選用10 mmol/L CaCl2作為外源施加Ca2+濃度。基于前期試驗，選用5 mmol/L LaCl3作為Ca2+抑制劑。通過外源施加Ca2+及其抑制劑，以探究Ca2+調控小麥幼苗耐鹽的作用機制。

2.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗生長的影響

外源施加10 mmol/L CaCl2和5 mmol/L LaCl3分別對正常及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理，處理144 h后觀察到不同處理組間小麥幼苗生長狀況出現顯著差異（圖3）。與對照組（CK）相比，NaCl處理后小麥幼苗生長狀況較差，其生長指標葉長、葉寬、根長和株高均顯著降低。NaCl脅迫下，外源Ca2+處理有助于緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的危害，其根長、株高、葉長和葉寬均顯著增加，但對正常生長小麥幼苗生長狀況及生長指標根長、株高、葉長和葉寬均無明顯影響；LaCl3處理后正常及NaCl脅迫下小麥幼苗生長狀況均顯著變差，其根長、株高、葉長和葉寬均顯著降低（表3）。

圖3 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗生長狀況的影響Fig. 3 Effects of exogenous Ca2+ on the growth of wheat seedlings under NaCl stress

表3 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根長、株高、葉長、葉寬的影響Table 3 Effects of exogenous Ca2+ on the root length, plant height, leaf length and leaf width of wheat seedlings under NaCl stress cm

2.3 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗TaCDPK27表達量的影響

CDPK作為鈣依賴蛋白激酶，其基因表達量與植物體內Ca2+濃度有密切聯系。外源施加CaCl2和LaCl3處理144 h后，通過RT-qPCR檢測正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達情況。與對照組相比，NaCl處理后小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量均顯著上調；外源Ca2+處理促進NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量顯著上調，但對正常生長小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達量均顯著下調（圖4）。

圖4 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaCDPK27表達情況的影響Fig. 4 Effects of exogenous Ca2+ on TaCDPK27 expression in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress

2.4 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的調控

2.4.1 MDC染色檢測小麥幼苗細胞自噬活性 為探究NaCl脅迫對小麥幼苗細胞自噬活性的調控，通過MDC染色對細胞自噬活性進行持續檢測。分別對NaCl處理0、3、6、12、24、48、72、96、120和144 h的小麥幼苗根進行自噬活性檢測，結果（圖5）顯示，NaCl處理3 h小麥幼苗根細胞有自噬現象發生，到6 h自噬小體顯著增多，NaCl持續處理12、24和48 h自噬小體無顯著變化，自噬活性處于穩定狀態，72 h自噬小體開始減少，到120 h自噬小體最少，自噬活性最低。然而NaCl繼續處理144 h時，自噬小體顯著增多，細胞自噬活性再次升高。鑒于NaCl處理6和144 h，小麥根中自噬小體顯著增多，因此，選擇這兩個處理時間進一步檢測Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的影響。

圖5 MDC染色檢測NaCl脅迫下小麥幼苗根中自噬小體（標尺=100 μm）Fig. 5 Autophagy activity of wheat seedling roots under NaCl stress detected by MDC staining（Bar=100μm）

為探究外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗細胞自噬活性的調控，外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理6和144 h后，對小麥幼苗根進行MDC染色。NaCl處理6 h時，與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗自噬小體增多，自噬活性增強；外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長小麥幼苗自噬活性無顯著影響；對NaCl脅迫下小麥幼苗進行CaCl2處理后自噬小體顯著增多，進行LaCl3處理后，自噬小體顯著減少。說明外源Ca2+促進NaCl脅迫6 h小麥幼苗適度自噬，有助于細胞修復NaCl脅迫危害（圖6-A）。NaCl處理144 h時，與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根細胞自噬小體增多，自噬活性增強；外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長小麥幼苗自噬活性無顯著影響；對NaCl脅迫下小麥幼苗進行CaCl2處理后根自噬小體顯著減少，進行LaCl3處理后，自噬小體顯著增多（圖6-B）。為進一步驗證此結果，對處理144 h小麥幼苗葉片細胞進行自噬活性檢測，不同處理組細胞自噬活性變化與根細胞變化趨勢保持一致（圖7）。即外源Ca2+處理減弱小麥幼苗根和葉片細胞由于NaCl脅迫導致的自噬活性異常升高。

圖6 MDC染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根自噬活性影響（標尺=100 μm）Fig. 6 Effects of exogenous Ca2+ on the autophagy activities of wheat seedling roots under NaCl stress by MDC staining（Bar=100 μm）

圖7 MDC染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫144 h小麥幼苗葉片自噬活性的影響（標尺=100 μm）Fig. 7 Effects of exogenous Ca2+ on the autophagy activities of wheat seedling leaves under NaCl stress at 144 h by MDC staining（Bar=100 μm）

2.4.2 RT-qPCR檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片TaATGs表達量變化 與對照組相比，NaCl處理導致小麥幼苗根和葉片中，TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著上調。外源Ca2+處理導致NaCl脅迫下小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著下調，但對正常生長小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組中小麥幼苗TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量均顯著上調（圖8）。結果表明，外源Ca2+能抑制NaCl脅迫下小麥幼苗TaATGs的過量表達。

圖8 RT-qPCR檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中TaATGs表達的影響Fig. 8 Effects of exogenous Ca2+ on TaATGs expression in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by RT-qPCR

2.5 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞活力的影響

2.5.1 伊文思藍染色檢測小麥幼苗根和葉片細胞活力 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h，利用伊文思藍染色檢測小麥幼苗根和葉片細胞死亡情況。小麥幼苗根和葉片中細胞死亡變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死亡細胞增多；外源Ca2+處理顯著減少NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死細胞數量，但對正常生長小麥幼苗根和葉片細胞活力無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片中藍色區域變大，死亡細胞明顯增多（圖9）。

圖9 伊文思藍染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞活力的影響（標尺=1 000 μm）Fig. 9 Effects of exogenous Ca2+ on cell viability in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by Evans Blue staining（Bar=1 000 μm）

2.5.2 TUNEL染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，通過TUNEL染色檢測小麥幼苗根和葉片PCD。小麥幼苗根和葉片PCD變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導致小麥幼苗根和葉片PCD顯著升高；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD，但對正常生長小麥幼苗根和葉片PCD無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片PCD均顯著升高（圖10）。

圖10 TUNEL染色檢測外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片PCD的影響Fig. 10 Effects of exogenous Ca2+ on PCD in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress by TUNEL staining

2.6 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片ROS的影響

2.6.1 DAB與NBT染色檢測小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-積累 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，分別用DAB和NBT染色檢測H2O2和O2·-在小麥幼苗根和葉片中的累積情況。小麥幼苗根和葉片ROS累積變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導致小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量升高（圖11）；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-的累積，但對正常生長小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量無顯著影響；外源施加LaCl3處理導致對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-累積量均顯著升高（圖11）。

圖11 DAB與NBT染色檢測外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗H2O2與O2·-累積量的影響（標尺=1 000μm）Fig. 11 Effects of exogenous Ca2+ on H2O2 and O2·- accumulation in wheat seedlings under NaCl stress by DAB and NBT staining（Bar=1 000 μm）

2.6.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，對小麥幼苗根和葉片進行H2O2與O2·-含量檢測。小麥幼苗根和葉片中H2O2、O2·-含量變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導致小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量顯著升高；外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量，但對正常生長小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量無顯著影響；無論是對照組還是NaCl脅迫組，外源施加LaCl3處理后小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量均顯著升高（圖12）。

圖12 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片H2O2與O2·-含量的影響Fig. 12 Effects of exogenous Ca2+ on H2O2 and O2·- contents in the roots and leaves of wheat seedlings under NaCl stress

2.7 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗POD、SOD、CAT活性影響

外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗處理144 h后，檢測小麥幼苗根和葉片POD活性。小麥幼苗根與葉片中POD活性變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導致小麥幼苗根和葉片POD活性顯著升高；外源施加CaCl2和LaCl3處理對正常生長小麥幼苗根和葉片POD活性無顯著影響；外源Ca2+處理顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片POD活性，外源施加LaCl3處理則顯著降低小麥幼苗根和葉片POD活性（圖13）。

圖13 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片POD活性影響Fig. 13 Effects of exogenous Ca2+ on the POD activities of wheat seedlings under NaCl stress

小麥幼苗根與葉片中SOD、CAT活性變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片SOD與CAT活性顯著降低；外源Ca2+顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片中SOD與CAT活性，但對正常生長小麥幼苗根和葉片SOD、CAT活性無顯著影響；外源施加LaCl3處理導致小麥幼苗根和葉片SOD、CAT活性顯著降低（圖14）。說明外源Ca2+處理增強NaCl脅迫下小麥幼苗抗氧化能力，減少NaCl脅迫對小麥幼苗的氧化損傷。

圖14 外源Ca2+ 對NaCl脅迫下小麥幼苗SOD、CAT活性的影響Fig. 14 Effects of exogenous Ca2+ on the SOD and CAT activities of wheat seedlings under NaCl stress

2.8 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗PSII的影響

2.8.1 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素熒光參數的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理。在處理第5天和第10天（表4）分別測定不同處理組葉綠素熒光參數。不同處理組各項葉綠素熒光參數在處理第5天和第10天時變化趨勢一致。與對照組相比，NaCl脅迫導致小麥幼苗葉綠素熒光參數Fv/Fm、Y（II）、qP、F0以及ETR均顯著降低，使葉綠素熒光參數NPQ顯著升高；外源Ca2+處理促進NaCl脅迫下小麥幼苗Fv/Fm、Y（II）、qP、F0以及ETR顯著升高，導致葉綠素熒光參數NPQ顯著降低，但對正常生長小麥幼苗葉綠素熒光參數無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組小麥幼苗各項葉綠素熒光參數變化與NaCl脅迫下各項參數變化趨勢一致，即Fv/Fm、Y（II）、qP、F0和ETR均顯著降低，葉綠素熒光參數NPQ顯著升高。說明NaCl脅迫與LaCl3處理均降低小麥幼苗PSII活力，外源Ca2+處理能減弱NaCl脅迫對小麥幼苗PSII損傷。

表4 外源Ca2+對NaCl脅迫5 d和10 d小麥幼苗葉綠素熒光參數的影響Table 4 Effects of exogenous Ca2+ on the chlorophyll fluorescence parameters of wheat seedlings after 5 d and 10 d of NaCl stress

2.8.2 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響 外源施加CaCl2和LaCl3對正常生長及NaCl脅迫下小麥幼苗進行處理，在處理5和10 d分別取小麥幼苗進行葉綠素含量測定。結果（表5）顯示，與對照組相比，NaCl脅迫后小麥幼苗葉綠素含量均顯著降低；外源Ca2+處理顯著增加NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量，但對正常生長小麥幼苗葉綠素含量無顯著影響；外源施加LaCl3處理后，對照組和NaCl脅迫組中小麥幼苗的葉綠素含量均顯著降低。

表5 外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響Table 5 Effects of exogenous Ca2+ on the chlorophyll contents of wheat seedlings under NaCl stress

3 討論

3.1 小麥幼苗對NaCl脅迫的生理響應及Ca2+緩解NaCl脅迫的生理機制

鹽脅迫是嚴重影響作物生長及生產的主要非生物脅迫之一。當植物遭受鹽脅迫時，其體內滲透壓會產生變化，導致根吸水能力降低［27］。長時間的鹽脅迫會抑制植物的離子轉運和光合作用，最終造成葉片的衰老及死亡［28］。Ca2+作為植物體內第二大信使，廣泛參與植物在各種生物脅迫和非生物脅迫下的信號傳遞，調控植物多種生理代謝過程［29］。NaCl脅迫能引起擬南芥幼苗體內胞質Ca2+濃度升高，Ca2+通道抑制劑LaCl3和Ca2+螯合劑EGTA均能抑制這種升高［30］。Ca2+信號被感受器感知后參與ABA信號轉導途徑，調節氣孔運動以及NaCl脅迫相關基因的表達［31］。CDPK作為Ca2+感受器，可以直接被Ca2+激活，其表達量的變化可反映植物體內Ca2+濃度對脅迫的響應［32］。本研究結果顯示，外源Ca2+可以緩解NaCl脅迫對小麥幼苗生長的抑制作用。NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片TaCDPK27表達量顯著升高，且經CaCl2處理后其表達量同樣具有上調趨勢，而外源施加LaCl3處理后根和葉片TaCDPK27表達量顯著下調。這些結果證明TaCDPK27參與調控外源Ca2+促進NaCl脅迫下小麥幼苗生長的過程。

NaCl脅迫下小麥的根和葉片中均產生過量ROS。其中H2O2和O2·-可以調節自噬和PCD［6］。H2O2和O2·-通過誘導自噬來緩解氧化脅迫。而植物體內的ROS產生的途徑包括：來源于細胞膜結合的NADPH氧化酶和葉綠體［33］。Ca2+通過增強細胞膜通透性，加強細胞膜對離子的選擇吸收能力，提高植物的抗氧化酶活性，降低ROS等有害物質對植物的傷害［34］。本研究也顯示了相似的結論。外源Ca2+處理顯著提高了NaCl脅迫下小麥幼苗中葉綠素含量以及促進光合作用的各種葉綠素熒光參數，增強其光合作用。同時，外源施加Ca2+導致NaCl脅迫下小麥幼苗中抗氧化酶SOD、CAT活性均顯著升高，有效清除由于NaCl脅迫造成的ROS積累，降低NaCl對小麥幼苗的損害。這些結果暗示，Ca2+、NaCl脅迫引起的ROS積累，自噬、PCD和葉綠素熒光參數間存在復雜的內在聯系。

3.2 外源Ca2+通過調控細胞自噬與PCD緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的危害

細胞自噬是真核生物中高度保守的過程，通過該過程將細胞質中的異常細胞器或蛋白質隔離到雙層膜的囊泡中，并傳遞到降解這些物質的細胞器中，從而達到回收大分子和確保細胞內穩態的目的［35］。逆境脅迫下，植物為維持體內穩態便會發生細胞自噬［36］，但自噬活性異常升高會導致細胞死亡，降低植物體內細胞活力，增加PCD［37］。ATG在調控細胞自噬中具有重要作用。ATG能從自噬小體的形成、自噬活性監測等方面調控自噬活性。ATG2為定位于自噬前體液泡周圍的點狀蛋白，具有促進自噬小體延伸和閉合的作用；ATG7是自噬結合系統和自噬體形成所必需的蛋白，ATG10與ATG5同樣作為參與自噬小體形成的關鍵因子之一，其表達量上調有助于促進細胞自噬［38］；ATG8定位于自噬結構膜上，由于其特征性的自噬膜定位而成為監測自噬活性的重要靶標［39］。本研究中，NaCl脅迫導致小麥幼苗根細胞自噬，外源Ca2+處理能促進自噬以修復NaCl脅迫危害，維持細胞穩態；而長時間NaCl脅迫會導致小麥幼苗自噬活性異常升高，外源Ca2+通過抑制自噬活性異常升高以調控NaCl脅迫對小麥幼苗的危害。這一結果也通過小麥幼苗根和葉片關鍵TaATGs表達情況進行了驗證，外源Ca2+處理能有效抑制由于NaCl脅迫144 h導致的小麥幼苗根和葉片中TaATG2、TaATG7、TaATG5、TaATG8和TaATG10表達量上調，從而降低細胞自噬活性，減少細胞凋亡。細胞中自噬活性升高會導致細胞凋亡［40］。

細胞凋亡是PCD的一種典型機制，在功能上與自噬不同［40］。在許多細胞類型和疾病條件下，激活自噬會抑制細胞凋亡，而抑制自噬則會激活凋亡過程［41］。在某些生理條件下，原本參與調節自噬的蛋白也可能誘導細胞凋亡。許多最終導致細胞凋亡的刺激也會在同一細胞中觸發自噬。自噬首先發生，隨著脅迫因子的持續存在，可能會導致細胞凋亡［35］。此結論在本研究中得到驗證，當小麥幼苗持續遭受NaCl脅迫144 h時，根和葉片自噬活性異常升高導致細胞死亡，同時PCD也顯著升高，細胞活力下降。外源Ca2+處理顯著降低NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片死亡細胞及PCD。由于NaCl脅迫下小麥幼苗根和葉片細胞內Ca2+與Na+濃度增加，導致植株啟動自身防御機制，發生細胞自噬，當NaCl脅迫持續144 h后，細胞內Na+持續積累，自噬活性異常升高，造成細胞死亡，且PCD升高，使小麥幼苗生長受到抑制；外源Ca2+對NaCl脅迫下小麥幼苗處理后，胞內Ca2+濃度升高導致其Na+濃度降低，NaCl對小麥幼苗的脅迫作用減輕，細胞內自噬小體適量減少，自噬活性降低，死亡細胞減少同時PCD下降，從而減弱NaCl脅迫對小麥幼苗的傷害。

4 結論

Ca2+通過調控小麥幼苗根和葉片的自噬水平限制PCD的規模，緩解NaCl脅迫對小麥幼苗的損傷。NaCl脅迫誘導小麥根和葉片自噬與Ca2+信號、氧化應激、光合反應之間存在著密切關系。