甘藍型油菜種子硫苷含量全基因組關聯分析

周會汶 吳蘭花 韓德鵬 鄭偉 余跑蘭 吳楊 肖小軍

（1. 九江學院 江西油茶研究中心 藥學與生命科學學院，九江 332005；2. 江西省紅壤及種質資源研究所 國家紅壤改良工程技術研究中心江西省紅壤耕地保育重點實驗室，南昌 330045）

油菜是我國重要的冬季油料作物，隨著科技的發展，油菜質量安全水平明顯提高［1-2］。油菜籽經榨取后的菜籽粕是豐富的飼料蛋白資源，但是餅粕中含有較多的抗營養因子，如硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡稱硫苷），其降解產物有毒，對動物的生長發育有嚴重危害，限制了菜籽餅粕在飼料中的應用［3-5］。因此，降低油菜種子中硫苷含量是油菜育種目標之一。

硫苷是一種廣泛存在于十字花科植物中的次生代謝產物，其基本結構為一個β-D-葡萄糖，連接一個磺酸鹽醛肟基團和一個來源于氨基酸的側鏈，根據側鏈基團化學結構的不同可將硫苷分為脂肪族硫苷、芳香族硫苷和吲哚族硫苷三大類［6-8］。目前硫苷的生物合成途徑及主要酶基因均已被證實［8-10］。硫苷的合成途徑包括前體氨基酸側鏈的延長、核心結構的合成和次級修飾3個主要部分。其中次級修飾情況最復雜，包括羧基化、甲基化、葡萄糖基化等次級修飾，不同的修飾途徑產生不同種類的硫苷。可見硫苷含量是一個復雜的數量性狀，受多基因控制。Feng等［11］以202份DH群體（Tapidor×Ningyou7）為材料，采用786個分子標記在4種環境中定位到了105個mQTL，其中有4個與種子總硫苷含量相關mQTL（q.mcG-A9a、q.mcG-A9b、q.mcG-C2b和q.mcG-C2c）在4種環境下均被檢測到。劉水燕等［12］以高硫苷‘GH06’、雙低油菜‘油研2號’為親本，構建了272份重組自交系群體，共檢測到了11個QTLs，分別位于8個不同的連鎖群。薦紅舉等［13］利用172份重組自交系的高密度SNP遺傳圖譜（包含2 795個SNP分子標記），檢測到的5個QTL在2年內被重復檢測到，分別位于A03、A09和C02染色體上。

隨著基因組重測序和高密度SNP芯片技術的快速發展，全基因組關聯分析（genome-wide association study，GWAS）已成為挖掘復雜農藝性狀相關遺傳位點的常用方法，具有不需要構建特殊的研究群體，可同時對多個性狀進行分析，較傳統QTL定位可以檢測到更多的SNP位點和候選基因等優點［14］。近年來在水稻［15］、玉米［16］、大豆［17］、油菜［18-19］等作物中均有廣泛應用。在油菜中，Wei等［19］在3種環境下重復檢測到4個位點與硫苷含量顯著關聯，分別位于A09、C02和C09號染色體上。劉蔚等［20］在203份自交系中使用60K SNP芯片對油菜種子硫苷含量進行GWAS分析，共檢測到了20個與硫苷含量顯著關聯的SNP，分別位于A02、A03、A09、C03、C08和C09染色體上。Tang等［21］基于基因組重測序在143份油菜中檢測到113個與硫苷含量顯著關聯區域，分別位于9條染色體上。在甘藍型油菜基因組中，是否還存在其他與油菜種子硫苷含量顯著相關位點，需進一步探究。

本研究以遺傳變異廣泛的300份甘藍型油菜自交系為材料，采用SLAF-seq（specific-locus amplified fragment sequencing）簡化基因組測序技術開發的201 817個SNP標記［22-23］，對該群體進行硫苷含量的全基因組關聯分析，旨在檢測與油菜種子硫苷含量顯著相關的SNP位點及候選基因，為選育低硫苷油菜新品種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以300份甘藍型油菜自交系為關聯分析群體，所有油菜種質均由江西農業大學作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 田間試驗與數據統計 300份油菜種質于2014年9月28日分別在江西農業大學試驗田（簡稱JXAU）、江西省紅壤及種質資源研究所油菜試驗田（簡稱JXIRS）播種，兩地各2個重復，在收獲種子后，采用近紅外分析儀（Perten DA7200，瑞典）測定油菜種子總硫苷含量，每個重復測定3次。經Excel、SPSS對測定數據進行統計分析。

1.2.2 基因型測序分型 在前期研究中，已采用北京百邁客生物科技有限公司開發的SLAF-seq技術，基于IlluminaHiSeqTM2500測序平臺對300份材料基因組DNA進行測序，參考基因組為甘藍型油菜品種Darmor-Bzh，群體相關SNPs與群體結構分析結果已在前期研究中報道［22-23］。

1.2.3 硫苷含量全基因組關聯分析 基于前期開發的201 817個SNPs標記，結合一年兩地油菜種子硫苷含量，使用TASSEL軟件的GLM（General linear model）模型和MLM（Mixed linear model）模型進行全基因組關聯分析［24］。根據GGplot2軟件［25］、QQman軟件［26］分別繪制Quantile-Quantile散點圖（Q-Q plot）、曼哈頓（Manhattan）圖，通過Manhattan圖顯示每個SNP位點的顯著性。其中，Manhattan圖顯著關聯SNP閾值取為1/SNP總數目的負對數，約為5.3。

1.2.4 候選基因預測 根據GWAS分析結果，將SNP定位到油菜參考基因組物理圖譜上，搜尋每個顯著SNP位點兩側100 kb范圍內的候選基因，利用BLAST軟件將候選基因分別與SwissProt、GO數據庫比對分析，以獲得候選基因的功能注釋信息，根據基因功能注釋篩選出與硫苷含量相關的候選基因。

2 結果

2.1 甘藍型油菜硫苷含量表型統計及方差分析

從表1中可以看出，在JXAU環境下，300份油菜種子平均硫苷含量為29.789 μmol/g，硫苷含量范圍為1.575-70.180 μmol/g，變異系數為63.52%；在JXIRS，所有材料平均硫苷含量為22.785 μmol/g，變異幅度為0.170-71.555 μmol/g，變異系數為81.55%。硫苷含量在兩地均表現為連續分布，表明甘藍型油菜種子中硫苷含量受多基因控制，適合QTL分析（圖1）。

圖1 甘藍型油菜種子硫苷含量頻次分布Fig. 1 Frequency distribution of seed glucosinolate contents of B. napus

表1 油菜籽硫苷含量統計分析Table 1 Statistical analysis of seed glucosinolate content in rapeseed

兩地試驗的方差分析結果顯示（表2），硫苷含量在300份油菜種質中表現出極顯著差異，硫苷含量在兩地表現出極顯著差異，說明環境對硫苷含量具有顯著影響。并且硫苷含量的基因型與環境互作方差達到了極顯著差異，在區組間差異不顯著。

表2 兩地環境下油菜種子硫苷含量的方差分析Table 2 Variance analysis of seed glucosinolate contents of rapeseed in two environments

2.2 甘藍型油菜硫苷含量全基因組關聯分析

采用GLM模型進行全基因組關聯分析油菜硫苷含量，在JXAU檢測到了89個顯著相關SNP位點（圖2，附表1），集中分布于A09（60個）和C09（11個）染色體上，單個SNP表型貢獻率（R2）為4.62%-12.40%。在JXRIS共檢測到183個顯著相關SNP位點，集中分布于A09（140個）和C09（30個）染色體上，表型貢獻率為4.34%-16.12%。此外，通過MLM模型在兩地分別檢測到58個（JXAU）、97個（JXRIS）顯著相關SNP位點（圖2，附表1），單個SNP表型貢獻率分別為5.72%-13.21%（JXAU）、5.04%-16.75%（JXRIS）。除了JXAU的1個SNP（Bna_C08_13781013）外，MLM模型檢測獲得的SNP位點均在GLM模型中被檢測，一共檢測到了209個與硫苷含量顯著關聯SNP。在GLM與MLM兩種模型、兩地同時檢測到的SNP有41個，SNP分別在A05（1個）、A09（36個）、C09（4個）3條染色體上。由于諸多SNP物理位置較近，將其命名為10個QTLs，分別為qSGC.A05.1、qSGC.A09.1、qSGC.A09.2、qSGC.A09.3、qSGC.A09.4、qSGC.A09.5、qSGC.A09.6、qSGC.C09.1、qSGC.C09.2、qSGC.C09.3（表3，圖2）。

圖2 硫苷含量全基因組關聯分析Manhattan和Q-Q plot圖Fig. 2 Manhattan and Q-Q plot of GWAS for glucosinolate content

表3 兩地重復檢測到顯著關聯SNPsTable 3 SNP significantly associated with SGC under JXAU and JXRIS

2.3 甘藍型油菜硫苷含量相關候選基因預測

根據油菜參考基因組注釋信息，在10個QTLs上下游100 kb區間內共挖掘到了427個候選基因，并對候選基因進行功能注釋，詳細注釋信息見附表2。在GO注釋中，有8個候選基因注釋在硫苷生物合成途徑（GO:0019761）生物學過程中（表4），其中3個基因為MYB基因家族（BnaC09g05290D、BnaC09g05300D、BnaA09g05480D），2個NRT1/PTR基因家族（BnaA09g06180D、BnaA09g06190D），其他3個候選基因分別編碼ATP硫酸化酶（BnaA05g16830D）、磷酸還原異構酶（BnaA09g06230D）、腺苷酸激酶（BnaC09g08710D），這8個基因分別在qSGC.A05.1（1個）、qSGC.A09.2（1個）、qSGC.A09.3（3個）、qSGC.C09.2（2個）、qSGC.C09.3（1個）等5個QTLs上。

表4 硫苷生物合成途徑（GO:0019761）注釋的候選基因Table 4 Candidate genes annotated with glucosinolate biosynthetic pathway（GO:0019761）

3 討論

硫苷主要分布于十字花科、白菜花科、番木瓜種子中，是一種重要的次生代謝產物，在很大程度上決定了餅粕的商業價值［4,8,27］。因此，選育低硫苷含量的新品種是甘藍型油菜的育種目標之一。甘藍型油菜種子中硫苷含量是一個復雜的數量性狀、受多基因調控，A09、C02和C09染色體是被公認的3個存在與種子硫苷含量顯著相關的主效QTL位點，同時在A01、A03、A08、C06、C07等染色體也檢測到相關位點［11,19-20,28-30］。Tan等［29］根據2017-2019年間505份種質種子硫苷含量，定位到了66個與硫苷含量顯著關聯的SNP位點，分別位于A02、A09、C02和C09上，其中3年均顯著關聯的位點為BnvaA0902677575、BnvaC0205007646、BnvaC0903100014。Liu等［30］同樣在A09、C09上定位到了2個QTL與硫苷含量顯著關聯，分別為GSL-A9（Bn-A09-p2733282）、GSL-C9-1（Bn-scaff_19783_1-p379086）。魏大勇等［31］檢測到了45個與油菜種子硫苷含量顯著關聯的SNP，主要分布于在A09（10個，物理位置在2 372 598-3 118 196 bp間）、C02（5個，物理位置在44 926 609-44 991 771 bp間）、C09（29個，物理位置在2 375 598-3 198 893 bp間）區間上。Qu等［32］在A09上染色體檢測到了6個SNP位點與硫苷含量顯著關聯，其中有4個位點在2年間均被檢測到，分別為Bn-A09-p3029767、Bn-A09-p3116738、Bn-A09-p3053532和Bn-A09-p1832760。諸多研究結果顯示，A09、C09號染色體上諸多位點在不同群體中重復被檢測到，表明這2個染色體上存在調控甘藍型油菜種子硫苷含量的主效QTL位點。與前人研究結果比較發現，本研究中檢測到的qSGC.A09.1、qSGC.A09.2、qSGC.A09.3、qSGC.A09.4、qSGC.A09.5、qSGC.A09.6、qSGC.C09.1、qSGC.C09.2與前人研究結果一致［29-32］；qSGC.A05.1、qSGC.C09.3為新檢測到的與硫苷含量顯著關聯的位點。與本研究組前期研究比較發現，qSGC.A09.1與芥酸含量（Bna_A09_1752479）顯著關聯，qSGC.A09.2與千粒重（Bna_C09_2586974、Bna_C09_2587207）、亞油酸含量（Bna_A09_2539185）顯著關聯，qSGC.A09.4與角果長度（Bna_A09_3899079）顯著關聯［33-35］。這表明A09、C09號染色體上存在調控硫苷含量、亞油酸含量、千粒重、角果長度等性狀的多功能位點，可開發為CAPS、KASP等分子標記。

在硫苷合成途徑中，R2R3-MYB類轉錄因子對吲哚族和脂肪族硫苷的生物合成具有重要的調控作用，其中MYB28、MYB34分別為脂肪族硫苷、吲哚族硫苷合成過程中的主效轉錄因子，對硫苷的合成起著重要作用［9,36-40］。本研究中，挖掘到了2個MYB28（BnaC09g05290D、BnaC09g05300D）、1個MYB34（BnaA09g05480D），其中2個MYB28在Tan等［29］研究中重復被檢測到，BnaC09g05290D、BnaC09g05300D分別在花后20 d與40 d、20 d顯著關聯。除MYB28外，在Tan等［29］研究結果中挖掘到8個候選基因與硫苷含量顯著關聯（附表3），其中有6個候選基因（BnaA09g05940D、BnaA-09g06240D、BnaC09g04070D、BnaC09g04210D、BnaC09g04310D、BnaC09g05410D）在花后20 d與40 d顯著關聯，分別位于qSGC.A09.3、qSGC.C09.1、qSGC.C09.2上；2個候選基因（BnaA-09g04790D、BnaC09g08710D）僅在花后40 d顯著關聯，BnaC09g08710D參與硫苷生物合成途徑（GO:0019761）。硫苷在植物中的積累是動態的，其合成部位與積累部位不同，硫苷主要在葉片中合成，通過莖稈轉運到種子中，在轉運過程中硫苷轉運蛋白（GTR1、GTR2）起著重要作用［41-44］。如在芥菜中敲除GTR2后，顯著降低了突變體種子中硫苷含量、葉片和角果皮中硫苷的積累量［45］。在本研究中，在qSGC.A09.3上挖掘到了2個與擬南芥AtGTR2（At5G62680）同源的候選基因BnaA09g06180D、BnaA09g06190D。與油菜種子硫苷含量顯著關聯位點附近的候選基因是否參與調控硫苷合成或者運輸還需進一步驗證。

4 結論

本研究通過對一年兩地300份甘藍型油菜種子硫苷含量的測定，基于SLAF-seq技術開發的201 817個SNP分子標記，經GWAS分析獲得了209個SNP位點與硫苷顯著關聯，在兩地兩種方法中重復檢測到41個位點，分別在A05（1個）、A09（36個）、C09（4個）3條染色體上。在顯著關聯SNP位點上下游100 kb共搜尋到427個候選基因，8個基因參與硫苷生物合成途徑，包含2個調控硫苷合成的轉錄因子MYB28基因（BnaC09g05290D、BnaC09g05300D）、2個硫苷轉運相關基因GTR2（BnaA09g06180D、BnaA09g06190D）。本研究檢測到的SNP位點與候選基因可為后續改良甘藍型油菜種子硫苷含量提供理論支持。

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