蒺藜苜蓿MtCIM基因結構和功能分析

謝宏 周麗瑩 李舒文 王夢迪 艾曄 晁躍輝

（1. 北京林業大學草業與草原學院，北京 100083；2. 北京泰德制藥股份有限公司，北京 100176）

Expansin是第一個被發現的細胞壁擴展蛋白［1］。在酸性條件下，它能斷裂纖維素微纖絲間以及其與木葡聚糖之間的氫鍵，誘導細胞壁進行不可逆的伸展，從而促進植物細胞的增大［2］。Expansin蛋白在植物生長發育程中扮演了重要角色［3］。

目前，大量研究已經證明，Expansin蛋白幾乎參與了植物生長發育全過程，包括種子發育［4］、葉片的生長和發育［5］、根的伸長、細胞的增大［6］以及側根形成［7］等。在水稻（Oryza satival）中，OsEXPA8的過表達不僅使水稻根系結構發生改變，同時也增加了水稻株高、葉片大小和數量［8］。Chen等［9］將小麥TaEXPA2轉入煙草中發現，煙草種子產量有所增加。另外，Expansin蛋白在植物的磷吸收方面也有一定的作用。通過分析大豆GmEXLB1發現，低磷脅迫誘導GmEXLB1在根系中過量表達，從而促進了擬南芥對磷的吸收［10］。GmEXPB2的過量表達有助于大豆根系生長和磷效率的提高［11］。同時，Expansin蛋白可以通過調控細胞壁的松弛，從而在植物適應環境脅迫過程中發揮關鍵作用［12］。在小麥中，過表達TaEXPA2可以提高抗氧化酶的活性，促進側根的生長，從而進一步增強其在干旱條件下的適應性［13］。在煙草中，EXPA4過表達的植株在干旱和鹽脅迫下呈現出更好的生長狀態［14］。過量表達GhEXLB2使棉花（Gossypium hirsutum）在萌發期、苗期及開花期表現出較強的抗旱性［15］。

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula），屬于豆科（Leguminosae），苜蓿屬（Medicago L.），一年生牧草植物，其生命周期短、倍性小（2n=16）、基因組小（454-526 Mb）［16］，具有穩定的遺傳轉化體系，是一種非常重要的豆科模式植物。因此，研究蒺藜苜蓿基因的功能，在基因層面對蒺藜苜蓿進行性狀培育和新品種的培育方面尤為重要。

目前，CIM在許多植物中已有研究，然而關于蒺藜苜蓿CIM基因的研究鮮有報道。本研究通過對蒺藜苜蓿CIM進行生物信息學分析、表達特征鑒定、亞細胞定位、轉錄自激活活性及轉基因功能研究等。探討MtCIM的功能，為后續深入研究該基因的網絡調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的紫花苜蓿和蒺藜苜蓿種子均由北京林業大學草業與草原學院提供。所有植物均在人工氣候箱中培養，培養條件包括：晝夜周期為16 h/8 h，溫度為25℃/23℃，濕度為56%。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 采用Primer Premier 5.0軟件進行引物設計。其中，引物3302Y-MtCIM-F/R用于構建亞細胞定位植物表達載體，通用引物3302Y-F/R用于植物表達載體檢測；引物pGBKT7-CIM-F/R用于酵母表達載體構建，T7 promter和3-BD用于酵母表達載體鑒定。引物MtCIM-RT-F/R用于MtCIM基因熒光定量檢測，通用引物MtActin-F/R用于內參基因Actin熒光定量檢測（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2 生物信息學分析 基于NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫MtCIM（Mtr_0118s0070）序列，使用DNA MAN軟件分析MtCIM的開放閱讀框和編碼氨基酸序列，同時對MtCIM蛋白質進行保守結構域分析。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/wetools/plantcare/html）數據庫和TBtools軟件對MtCIM上游DNA區域進行順式調控元件分析。SOPMA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/home）被用于MtCIM蛋白的結構分析。

1.2.3 過表達載體3302Y-MtCIM構建 根據MtCIM的cDNA全長序列和3302Y植物表達載體的質粒圖譜設計引物3302Y-MtCIM-F/R，以含有MtCIM克隆質粒為模板，用3302Y-MtCIM-F/R為引物進行PCR擴增。再將3302Y載體于37℃進行15 min酶切。利用無縫連接酶將純化后的PCR產物與酶切質粒產物進行連接，50℃連接20 min，將連接產物轉入大腸桿菌感受態，并將其菌液涂在含有50 mg/L卡那霉素的抗生素固體LB培養基上進行挑選，將其置于37℃恒溫箱中培養8 h，挑取生長于抗生素培養基上的單菌落為模板，通用引物3302Y- MtCIM -F/R進行PCR擴增。PCR產物取4 μL經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶大小符合的PCR產物送公司測序。經序列比對將序列正確的菌液，提取質粒用于后續試驗。

1.2.4 亞細胞定位 采用CaCl2凍融法將3302Y-CIM重組質粒轉入EHA105農桿菌感受態中。以健康生長1個月左右的健康煙草為材料，用注射器將菌液注射到葉片中，將完成注射的煙草置于人工氣候箱中黑暗培養48 h。經過處理后，制作葉片玻片，將玻片倒置在激光共聚焦顯微鏡下捕捉熒光信號，并分析確定目的基因在細胞內的定位情況。

1.2.5 表達分析 分別用10 μmol/L ABA、10 μmol/L GA3和10 μmol/L IAA噴施處理生長健康且長勢一致的蒺藜苜蓿植株，采集不同時間點的葉片組織，液氮速凍后，-80℃存儲。提取上述材料的總RNA，并反轉錄為第一鏈cDNA，使用二步法進行熒光定量RT-PCR反應，程序為95℃ 10 s，68℃ 1 h，40循環。3次生物學重復，采用2-△△Ct法［17］計算基因相對表達量，運用Excel 2010對數據進行整理及圖表制作，利用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析。

1.2.6 轉錄自激活檢測 利用實驗室已構建的pMDCIM質粒為模板，使用引物pGBKT7-CIM-F/R進行PCR擴增，反應程序為95℃ 10 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，25循環；72℃ 5 min；12℃保溫。同時，提取酵母表達質粒pGBKT7，使用限制性內切酶Nco I進行單酶切，即37℃ 5 min。對PCR產物和酶切質粒分別進行純化后，按照1∶1比例，使用無縫連接酶進行連接反應，即55℃ 15 min。連接產物轉化至感受態大腸桿菌細胞，經50 mg/L卡那霉素篩選、挑選單克隆菌落以及菌體PCR鑒定后，將含有目標條帶的大腸桿菌單克隆菌落送至生物技術公司進行測序分析。提取BD-CIM質粒，利用酵母轉化試劑盒，將質粒轉化至酵母菌Y2H Gold中。轉化后的酵母經SD/-Trp篩選后，挑選單克隆菌落提取酵母質粒，使用T7 promoter和3'BD引物引物進行PCR檢測。將含有正確條帶大小的PCR產物送至生物技術公司進行測序分析。

將含有BD-CIM的Y2H Gold酵母菌，使用0.9%NaCl進行稀釋后，分別滴加于SD/-Trp、SD/-Trp-His-AdeA平板上。放置于30℃恒溫培養箱中倒置培養5 d。待培養結束，對酵母生長情況進行觀察拍照。

1.2.7 轉基因植株葉片形態檢測 選擇生長狀態一致的轉基因和野生型植物葉片進行顯微分析。將葉片保存于50% FAA固定緩沖溶液中。隨后，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行番紅固綠染色、石蠟切片及光學顯微鏡下的電鏡掃描分析。

1.2.8 轉基因植株不同磷濃度處理 選擇生長狀態一致的轉基因植株及野生型植株，轉移至全蛭石中，置于培養箱中繼續培養。待生長狀態穩定后，分別施加全磷（正常霍格蘭溶液）及低磷（磷含量為正常霍格蘭溶液1%）霍格蘭營養液，頻率為1周/次，經過1個月的培養，觀察其生長狀態，并進行拍照分析。

2 結果

2.1 生物信息學分析

MtCIM（基因登錄號：2723885）具有828 bp的開放閱讀框，編碼275個氨基酸。分子式為C1305H2002N354O406S13，蛋白分子量為29.563 kD，理論等電點為5.54。其中正電荷殘基數為23，負電荷殘基數為29；脂溶系數為75.16；不穩定系數為41.62，總平均親水性為-0.178，結果表明，MtCIM是一個親水性不穩定的蛋白。

二級及三級結構預測表明，MtCIM蛋白主要由無規則卷曲構成（圖1），占二級結構總比例的49.09%，其中，α-螺旋占10.91%。同時，含有延伸鏈31.64%和β-轉角8.36%。利用Signal 5.0網站進行MtCIM蛋白信號肽預測，結果（圖2）顯示，MtCIM存在信號肽（95.463%），定位于蛋白質的N端區域，信號肽序列為：MALTLEHAFSHILILLGLLSIFLVNPSF，類型：SP（Sec/SPI）。

對MtCIM上游的啟動子序列進行順式作用元件分析，結果顯示，MtCIM的上游啟動子區域除了含有核心啟動元件TATA box，還存在多個光響應元件，如TCT-motif和G-BOX，防御和脅迫反應元件TC-rich repeats，以及參與厭氧誘導元件ARE等。同時，存在多種激素相關的反應元件，如ABRE、P-box、TGA-element，分別參與脫落酸、赤霉素、生長素的信號通路（表2）。該基因啟動子區域分析表明，MtCIM可能在脫落酸、赤霉素、生長素響應或信號傳導等方面發揮重要作用。

表2 MtCIM啟動子的主要順式作用元件Table 2 The main cis-acting elements of MtCIM promoter

2.2 亞細胞定位

在煙草葉片中瞬時表達MtCIM-GFP融合蛋白，并使用激光共聚焦顯微鏡下捕獲熒光信號。結果（圖3）顯示，在細胞質中有強烈的熒光信號，表明MtCIM蛋白的亞細胞定位于細胞質中。

圖3 MtCIM的亞細胞定位Fig. 3 Subcellular localization of MtCIM

2.3 表達分析

為探究MtCIM在不同激素處理下的表達特征，對蒺藜苜蓿分別噴施ABA、GA3、IAA激素，分析MtCIM在處理后12 h內的表達情況。結果（圖4）表明，經ABA和GA3處理后，MtCIM表達量在短時間內快速升高，在10 min達到最高，隨后便呈下降趨勢；經IAA處理后，表達量整體呈現上升趨勢，在處理1 h時達到最高水平，是未處理樣品表達水平的4.22倍。

圖4 不同激素處理下MtCIM在蒺藜苜蓿中的表達分析Fig. 4 MtCIM expression analysis in Medicago truncatula under different hormone treatments

2.4 轉錄自激活活性驗證

為了研究MtCIM是否具有轉錄自激活活性，對MtCIM進行自激活活性驗證（圖5）。將pGBT7-CIM載體轉入Y2Hgold酵母感受態后，將其接種在SD/-Trp培養基上發現，在SD/-Trp培養基上酵母菌落能正常生長。隨后，挑取在SD/-Trp培養基上正常生長的陽性菌落，分別稀釋10、100、1 000倍，點涂在SD/-Trp/-His/Ade培養基。30℃培養2-3 d后，pGBT7-CIM在SD/-Trp /-His/Ade培養基幾乎無菌落生長。結果表明，CIM不具有自激活活性，可用于后續互作蛋白的篩選試驗。

圖5 pGBKT7-CIM轉錄自激活檢測Fig. 5 Transcriptional self-activation testing of pGBT7-CIM

2.5 轉基因植株葉片形態分析

通過對野生型和MtCIM過表達植株的葉片結構進行深入分析。結果（圖6）顯示，與野生型相比，轉基因植株的葉片角質層厚度有所增加。在對照組葉片中，其細胞大小均勻一致，排列規整，并且呈橢圓形。然而，轉基因植株葉片中的細胞呈現出不規則的排列模式。此外，比較發現，轉基因植株的上表皮細胞和髓細胞數量較對照組明顯減少。結果表明，在生長和發育過程中，轉基因植株的細胞壁厚度有明顯增加的趨勢。

圖6 番紅固綠染色法對葉片結構的觀察Fig. 6 Observation of leaf structure by saffred solid green staining method

2.6 轉基因植株不同磷濃度處理

通過對實驗室之前獲得的20株轉基因植株進行研究［18］。對轉基因和野生型植株在同一時間進行扦插（圖7-A, B），生長10 d后分別在全磷和低磷條件下進行培養（圖7-C, D）。結果顯示，在全磷條件下，轉基因植株與野生型植株呈現相似的生長狀態；而在低磷條件下，轉基因植株生長狀態較好，與野生型植株相比轉基因植株生長速度較快，株高達到野生型植株的2倍左右。以上結果表明，與野生型相比，轉基因植物更適應在低磷條件下生長。

圖7 全磷和低磷處理下轉基因和野生型植株差異Fig. 7 Difference between transgenic and wild type plants under total phosphorus and low phosphorus treatment

3 討論

近年來，前人對CIM在其他物種中的功能進行了大量研究發現，CIM幾乎參與調節植物生長發育的全部過程，尤其在調節植物細胞分子水平和組織器官水平過程中起到了至關重要的作用［14］。但在苜蓿中，關于CIM方面的研究還鮮見報道，CIM全長828 bp，編碼275個氨基酸，其理化性質分析表明，CIM為親水性不穩定的蛋白。亞細胞定位對蛋白質如何發揮其功能具有重要意義，蛋白質只有準確定位到其特定的位置上才能行使其功能［19］。本研究通過融合表達MtCIM-GFP來追蹤目標蛋白質的亞細胞定位情況，利用煙草葉片瞬時表達方法，操作簡單方便，瞬時表達率高。亞細胞定位結果顯示，CIM蛋白定位在細胞質中，說明可能在細胞質中發揮其功能。

啟動子位于基因的上游，調控著基因的轉錄起始，決定著轉錄的起始方向和轉錄效率［20］。同時，在啟動子上也存在著許多與逆境和激素響應有關的順式作用元件，這些順式作用元件可以和反式作用因子相結合進行不同的基因表達調控［21］。因此，分析MtCIM順式作用元件，對于研究該基因的表達調控具有重要意義。利用PlantCARE 軟件分析CIM啟動子區域發現，該啟動子區域除了核心作用元件以外，還含有許多激素響應元件，如ABA響應元件ABRE、GA響應元件P-box和生長素響應元件TGA-motif等。生長素是最早發現的植物激素，具有促進植物的伸長生長、促進器官與組織分化，同時防止器官脫落等功能［22］。目前，一些研究已表明，Expansin蛋白能夠響應生長素的誘導，在水稻中IAA能夠影響多種Expansin蛋白基因的表達，其中包括誘導EXPA1、EXPB3和EXPB7上調表達［23］。在黃瓜中，CsEXPb1的表達受到生長素、細胞分裂素和赤霉素等激素誘導后均上調［24］。本研究中，ABA、IAA、GA3的激素誘導均能改變MtCIM的表達。因此，MtCIM的表達受到多種激素調控，并且可能通過激素網絡來調控植物生長發育。

此外，該啟動子區域還包含光響應元件G-Box、防御和脅迫反應相關的元件TC-rich repeats等。研究表明，Expansin蛋白在多種逆境脅迫中發揮至關重要的作用［25］。丁安明等［26］在煙草中發現，過表達NtEXPA12后，能促進煙草種子在ABA培養基上的萌發率，并增強在干旱脅迫條件下的生存。同時，過表達AtEXPA4的擬南芥植株也具有干旱及耐鹽性的特征［27］。本研究發現，MtCIM啟動子序列上有多種逆境脅迫相關元件并且MtCIM基因能夠被ABA和IAA誘導。因此，推測MtCIM能夠通過激素調控網絡，參與植物逆境脅迫響應，進而影響植物生長發育。但MtCIM如何參與逆境脅迫響應機制還需要進一步研究。

近年來，研究發現Expansin蛋白能夠參與調控植物細胞伸展和生長發育［28］。植物在缺少磷素時，通常會表現為生長緩慢、矮小、葉色暗淡無光澤［29］。Expansin蛋白在植物對磷的吸收方面也具有一定作用。在擬南芥中GmEXLB1［11］的過表達改變了其根系的結構，進而提高了擬南芥對磷的吸收。本研究發現，在低磷條件下，與野生型相比，轉MtCIM苜蓿植株生長狀態更好，生長速度更快，這說明MtCIM株系更能適應低磷環境。因此，推測MtCIM可能在低磷條件下提高紫花苜蓿對磷的吸收，促進植物的生長發育。

4 結論

低磷條件下，MtCIM能夠促進紫花苜蓿的生長發育。另外，MtCIM可能通過ABA、IAA途徑參與植物逆境脅迫響應機制，進而影響植物的生長發育。