微藻基因工程研究進展

孫浩源鄧曉東翟曉旭高景文唐欣欣薛春梅

(1.佳木斯大學生物與農業學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 海口 570100)

微觀藻類(微藻)是最古老的低等水生生物之一，其結構簡單，個體微小，有單細胞或多細胞(絲狀體、膜狀體)2種類群，需要借助顯微鏡輔助才能觀察其形態。微藻種類繁多，分布廣，生活史豐富，適應能力強，能進行光合作用，能在多種極端環境如高鹽或者高溫環境下生存，是最簡單的初級生產者。目前，微藻能通過代謝合成多種生物活性物質，如蛋白質、脂肪酸、維生素、色素、甾醇、多酚、黃酮、萜類、多糖等。微藻不僅在醫藥保健，食品研發，環境保護，工業生產，土壤改良，生態系統恢復等諸多方面均有應用，同時微藻作為基因工程受體而得到廣泛關注，與高等陸生植物相比，微藻結構優勢更利于操作，繁殖更快，光合效率更高，單位面積產量是陸生高等植物的若干倍。與模式生物大腸桿菌相比，微藻表達產物更易純化，不含包涵體，更加安全無內毒素與外毒素產出，其培養基為簡單的無機鹽，更利于培養。與病毒相比微藻作為基因工程的載體更加易合成，免疫排斥反應低，轉化承載能力更強。

1 轉化方法

隨著人們對微藻基因工程的不斷深入研究，微藻在基因工程的應用越來越受到人們的重視，目前能夠成功高效轉化的微藻種類并不多，因此開發更加有效的轉化方式是十分必要的。現有的轉化方式多為玻璃珠法，電擊法，基因槍法，農桿菌介導法等。

1.1 玻璃珠法

目前使用最廣泛的將目的基因轉入微藻的方法是玻璃珠法。其原理是利用玻璃珠漩渦震蕩時產生的瞬間切力將目的基因導入微藻細胞中。1990年Kindle等首次提出衣藻的細胞核核轉化技術，并發現玻璃珠轉化的效率與微藻生長狀態有密切聯系：當微藻生長到達指數生長期時(1×106個·mL-1)，外源基因與微藻的比重達到2μg∶3×107個時轉化效率最高。同時，實驗中使用雙質粒與玻璃珠共同轉化，并發現使用雙質粒的共轉化會使外源基因插入載體頻率變高，得到轉化微藻更加容易[1]。黃非等利用玻璃珠法對萊茵衣藻精氨酸缺陷型轉化體系進行優化，轉化具有35S啟動子及GUS標記基因的pBI221質粒，發現質粒2μg，微藻個數達到3×107，30min，37℃預處理并震蕩30s時轉化率較高，同時微藻的細胞完整性較好[2]。

玻璃珠法高效便捷，成本低廉，對實驗室級別沒有較高的要求。但是玻璃珠法的操作對象只針對于缺壁的微藻細胞或者原生質體，對于帶有細胞壁藻類轉化效率較低。

1.2 電擊法

電擊法就是電穿孔法，當微藻的細胞受到瞬間脈沖電場的作用時會發生細胞膜透化，細胞膜產生可逆微孔通道，外源基因通過微孔進入微藻細胞，從而實現外源基因與微藻基因組的整合。

研究表明，當對電擊條件進行改良后如脈沖強度，脈沖時間等，電擊法的轉化效率是玻璃珠法的2倍[3]，同時通過電擊法導入的外源基因包容性更高，能接受更長的目的片段導入[4]。用電擊法轉化微藻時發現外源基因的濃度與轉化效率成正相關[5]。宋程飛等在VsDGAT1a基因導入杜氏鹽藻時，以pCAMBIA3301為載體，發現當電擊參數為0.4Kv和4ms時，轉化效率是現有轉化條件的1.14倍，微藻轉化率為2.26%。這說明電擊法的參數對外源基因導入微藻的效率起著決定性作用[6]。劉佳等在利用電擊法探究萊茵衣藻轉化最佳條件時，將外源基因與綠色熒光蛋白(GFP)組合，轉化結果可直接用肉眼觀測[7]，這將為電擊法的不斷優化提供新思路。

電擊法操作簡單，與玻璃珠法相比，電擊法不僅可以作用于缺壁細胞，同時可作用于完整的帶壁的微藻細胞，轉化范圍更加廣泛。然而由于電擊條件影響因素較多，受體細胞致死率較高，對外源基因的用量較大，穩定性與實驗的重復性較低。

1.3 基因槍法

基因槍法是粒子轟擊法的別稱，其原理主要是利用金或鎢將外源基因包裹在內形成金屬微粒，利用動力系統，在氦氣的驅動力作用下將其高速打入受體細胞內。

Klein等最早利用此方法將煙草的RNA導入植物細胞中[8]，此后，陸續將該方法用于微藻的轉化之中。Wannathong等利用此方法在綠藻中實現了生長激素的合成[9]。Kindle等將nit1轉入衣藻中[10]，Debuchy也實現了ASL對衣藻的轉化[11]。閆晉飛等將外源基因通過基因槍的方法轉入雨生紅球藻[12]。陳禹先等對基因槍法進行優化，在三角褐指藻轉化中調整目標載體0.75mg轟擊量，轟擊間距A-C分別是6.35mm，11mm，C為6cm時轉化效率最高，使轉化效率提升4.730倍。此轉化參數同樣適用于杜氏鹽藻、小球藻的轉化，為微藻基因工程技術提供更加可靠的轉化技術[13]。

但使用基因槍法得到的轉化藻不穩定，會出現基因突變或部分基因沉默等不利于外源基因在靶細胞內穩定表達的現象。同時，該方法受到微粒的性質、大小和速度、到固定細胞的距離、要轟炸的細胞數量、重組質粒的線性化或環狀形式以及靶DNA的濃度等多因素影響，可重復性低，使用具有一定局限性[14]。

1.4 農桿菌介導法

農桿菌介導法的原理是用將外源基因插入Ti質粒中，再利用農桿菌的侵染作用將帶有外源基因的Ti質粒插入受體細胞中，農桿菌介導法多用于植物基因工程的轉化中，也可用于衣藻的細胞核轉化中。結果顯示，該轉化方法在萊茵衣藻的細胞核轉化中是玻璃珠法的50倍[15]，郭娟娟等在利用農桿菌轉化異養蛋白核小球藻時對轉化條件進行優化，調整菌液初始吸光度OD600nm為0.8，藻液濃度107個·mL-1，調整培養基酸堿度到pH=5.4后，僅2d便可以看到清晰的轉化子，轉化時間比使用自養微藻縮短3～5倍[16]。雖然該方法與其他方法相比在使用過程中會出現轉化子假陽性的可能行更高，但因成本低廉，可重復性強，周期短，基因沉默效應較低的優點而受到青睞[17]。

1.5 其他

除去上述比較常用的轉化方法外，也有一些其他微藻轉化方式。Debuchy等利用顯微注射法將ARG7基因導入微藻之中，使精氨酸缺陷型藻株恢復產精氨酸的能力[18]。陳秦運用轉座子的方式向浮絲藻中mcy基因插入轉座子ISPlr1，探究轉座子ISPlr1與mcy基因的密切聯系[19]。人工轉座子的原理是將轉座子與轉座酶的組合，將外源基因插入微藻靶細胞。此外，利用Cre/loxP重組酶系統可將外源基因與抗性標記整合，解決了含有多個轉基因的大質粒往往因為缺乏或不合適的酶切位點而不能轉化的難題[20]。同時，碳化硅細絲轉化法[21]、脂質體法[22]、納米顆粒法[23]、超聲波法[24]等方法也被用于微藻的基因工程中。隨著基因工程的飛速發展，選擇合適的外源基因轉化方法，將為微藻改造提供更加便捷的操作，更加有利的條件。

2 轉化位置

全球已經有2萬余種微藻種類被鑒定，除了較多種類的真核微藻如綠藻、硅藻、甲藻、褐藻外，還有種類較少的原核微藻，如藍藻、念珠藻、魚腥藻等[25]。到目前為止，成功進行基因工程改造的微藻已經40多種，包括萊茵衣藻、普通小球藻、藍藻等[26]。原核微藻結構簡單，與真核微藻相比更易操作。而真核微藻在細胞結構上更復雜，代謝途徑更多樣，分化成度更高。具有被核膜包被的細胞核、葉綠體、線粒體結構，這為微藻種質資源和性能的提升提供更多的可能性。

2.1 細胞核轉化

細胞核是遺傳和代謝的控制中心。目前微藻的核轉化技術得到普遍應用，徐曉婷等構建鈍頂節旋藻的藻藍膽素的血紅素氧化酶基因(ho)和鐵氧還蛋白氧化還原酶基因(pcyA)的轉化載體，該載體同時含有別藻藍蛋白β亞基基因(apcB)，并轉化進萊茵衣藻的細胞核中以此探究重組表達藍藻藻膽蛋白對微藻異源類囊體膜光合作用的影響[27]。通常細胞核轉化的工程微藻篩選方法為抗生素抗性篩選，從印度斯坦鏈球菌中篩選出的Ble是最常用的抗生素選擇[28]。除此之外，草劑抗性篩選和營養缺陷型篩選也被用于轉基因微藻的篩選。核表達在微藻轉化中效率高，易操作。但是仍存在一些問題，如靶基因隨機整合位置的隨機性，外源基因整合到核基因組是不確定的，這導致相同的轉化之間也存在差異，需要進行廣泛的篩選才能篩選出高效的克隆。同時進行細胞核轉化時仍舊存在基因沉默現象，這些都有可能導致外源基因導入失敗或者基因產物含量過低的情況出現[29]。

2.2 葉綠體轉化

不同于高等植物每個細胞中擁有多個葉綠體，大部分的微藻具有一個葉綠體，其體積占微藻細胞總體積50%以上，在基因工程中此特點對獲得純凈的轉化株系十分有利[30]。葉綠體在進化中被認為是藍藻的衍生物，與藍藻相比其基因序列顯示出相似性，但基因組大小與藍藻相比減小很多[31]。微藻的葉綠體基因組可以歸為3類：參與編碼光合作用的基因；參與編碼葉綠體基因表達所需要的基因；參與編碼不同過程所需蛋白質基因[32]。目前，比較常見的2類真核微藻葉綠體表達系統主要是利用細胞器表達，就是將目的基因直接插入到葉綠體中進行重組表達。另一種是與細胞核表達系統結合，葉綠體中的很多蛋白由細胞核編碼，經跨膜，去葉綠體轉運肽，折疊，嵌合細胞核表達系統構建構建葉綠體表達工廠。研究表明，對葉綠體基因的表達調控在翻譯水平上更加敏感[33]，Rasala等在2011年在萊茵衣藻的表達元件的改造中采用強啟動子，結果顯示，外源基因的mRNA表達水平顯著提高，蛋白積累量也明顯增加，這說明對葉綠體表達系統的調控可以通過控制表達元件的方法控制外源基因表達[34]。

自1988年，葉綠體表達系統首次通過基因槍法實現在萊茵衣藻中的穩定表達[35]，至今已經能夠通過葉綠體表達系統生產疫苗，醫用抗原，重組蛋白，商業酶等，逐漸被廣泛應用。葉綠體表達系統的優勢在于在外源基因導入時無基因沉默現象的產生，外源基因是通過同源重組整合到微藻中的。由于葉綠體表達系統翻譯后修飾的特點，也使外源基因的表達更加穩定。同時，葉綠體的基因組中更多的拷貝數確保了目的基因的表達量，保證了更多的基因產物積累[29]。對于一些特殊產物也更具有包容性，如內毒素，葉綠體的特殊結構給予其類似于原生細菌的環境，并且由于葉綠體的區室化不會影響正常微藻細胞的生理活性。2017年Stoffels等在萊茵衣藻的葉綠體中生產出內毒素Cpl-1和Pall，該產物對肺炎鏈球菌有一定的抗性作用[36]。但是葉綠體表達系統的轉化對外源基因的大小和所插入的位點有一定限制。

2.3 線粒體轉化

真核微藻的線粒體與葉綠體類似，都是具有半自主性的細胞器，能夠獨立進行基因復制、轉錄與蛋白質合成。但是與細胞核不同，雖然二者都以半保留復制進行遺傳物質傳遞，但線粒體的2條鏈在復制時不是同步進行[37]，同時在密碼子選擇上具有偏向性[38]。與細胞核轉化與葉綠體轉化相比，微藻的線粒體轉化是十分困難的，外源基因轉化效率低且報道也較少，對于調控機理研究也相對淺顯。迄今為止，在微藻中只有萊茵衣藻能夠實現線粒體的遺傳轉化。Randolph-Anderson等將萊茵衣藻CC-125中CYB基因導入缺陷株的線粒體中，得到代謝功能完善的藻株[39]。胡章立等[40]在萊茵衣藻的線粒體中表達了外源基因egfp，隨后又表達了細菌的外源基因ble。

3 展望

微藻種類繁多，不僅適應能力強，具有類似微生物的生長迅速的特點，同時又因為細胞器的存在，使其生理結構更加復雜，使微藻在擁有真核表達系統的同時又擁有原核表達系統。為了充分開發利用藻類的基因工程潛力，需要建立更加簡化、靈活、高效的表達載體，并嘗試不同組合的表達元件，更換不同類型的啟動子或者復制子調控外源基因的表達。這需要研究者對微藻基因工程的調控機理進行更深入更廣泛的研究，涉及到不同系統之間的調控，外源基因在微藻中表達所經歷的表達過程，以及外源基因表達產物與微藻自身的相互作用。需要展開更細致的工作，建立新的體系，引入新的技術。目前隨著萊茵衣藻的全基因組測序完成，為萊茵衣藻基因工程改造提供更多操作上的選擇性，成就了萊茵衣藻在藻類的合成生物學與系統生物學上的優勢地位，萊茵衣藻已經成為微藻轉化的模式生物。但是對于其他藻類的改造仍在起步階段，與萊茵衣藻在基因工程改造方面仍然存在巨大差距，這極大限制了微藻基因工程改造的發展進程，不同微藻的遺傳背景具有高度特異性，所以對于微藻的基因工程改造仍需要進一步探索，從實驗室到工業化進程仍然有很大的進步空間。將新技術、新體系引入更多種類的微藻改造之中，是人們將面臨的下一步挑戰。