miR-223 對脂多糖誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的影響

趙天奪，王若薇，張莉，魏祥飛，楊慧琳，符海鑫，王春梅

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

0 引 言

MicroRNA（miRNAs）是一類長度約22 個核苷酸且高度保守的內源性非編碼RNA，通過與mRNA 的3’UTR 結合，降解和/或抑制翻譯其結合的靶基因，在轉錄后調節基因的表達[1-4]。成熟的miR-223 長度為22 nt，它的基因位于奶牛、人類和小鼠的X 染色體中[5-8]。目前對于miR-223 的研究大多都集中于癌癥和炎癥性疾病方面[5,9-13]，如miR-223 已被證實通過靶向FOXO3a 來抑制肝癌細胞中的過度自噬[14]，也可靶向RhoB 來促進胃癌中的腫瘤進展[12]。然而也有研究報道，miR-223-3p 通過靶向NLRP3 來抑制視神經膠質瘤細胞增殖，發揮抗癌作用[11]，同樣也有研究發現，miR-223 在奶牛乳腺炎和牛子宮內膜炎等組織中的表達量均顯著上調[15-16]，因而被認為是炎癥性疾病的關鍵調節因子。眾所周知，奶牛乳腺炎嚴重束縛著奶業的進展，病原微生物的感染是造成奶牛乳腺炎的原因之一。研究發現miR-223 可通過靶向CBLB 和抑制下游的PI3K/AKT/NF-κB 通路來減輕金黃色葡萄球菌誘導的炎癥進展[17]，并且大腸桿菌也是引起奶牛乳腺炎的主要病原體之一，其通過產生內毒素LPS誘發炎癥反應[18-19]。在前期的實驗中發現LPS 的添加可導致DCMECs 中miR-223 的表達有所差異，而目前miR-223 是否可以調控LPS 誘導的奶牛乳腺炎與乳脂合成還沒有研究報道。因此本研究以DCMECs為研究模型，探究miR-223 對使用LPS 炎癥造模后的細胞炎癥反應及乳脂合成的影響，旨在為治療乳腺炎和提高乳品質提供參考。

1 材料方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清，Absin；DF12 培養液干粉、膠原酶Ⅳ、脂多糖（LPS）、尼羅紅（Nile Red），Sigma；TRIzol，Ambion；胰酶，Giboc；角蛋白18（CK-18）抗體、驢抗兔lgG/FITC 二抗，Bioss；β-actin 抗體，Santa Cruz；TNFα 抗體，Wanleibio；FASN 抗體、HRP-山羊抗兔/鼠lgG 抗體，ABclonal；miR-223 過表達片段（mimics）、過表達陰性對照片段（mimics NC）、染料法Hairpin-it miRNAs qRT-PCR 定量試劑盒，吉瑪基因；LipofectamineTM2000（Lipo2000）脂質體轉染試劑，invitrogen；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，碧云天；細胞培養箱、熒光顯微鏡、熒光定量PCR 儀，Thermo。

1.2 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養與鑒定

取處于泌乳期健康的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，采用膠原酶消化法體外分離培養原代DCMECs。培養5 d 左右，根據成纖維細胞與乳腺上皮細胞對胰酶耐受程度的不同，進一步純化獲取DCMECs。將純化后的DCMECs 采用免疫熒光方法鑒定CK-18，應用FITC 標簽的熒光二抗標記CK-18，DAPI 標記細胞核。

1.3 添加LPS 對奶牛乳腺上皮細胞炎癥蛋白因子的影響

將處于對數生長期的DCMECs 傳于6 孔板，當細胞密度達80%時，棄培養液，分別加入含有LPS 終濃度為0.1、1、10 μg/mL 的細胞培養液，同時建立不加LPS 的對照組。培養24 h 后提各組總蛋白，Western blot 檢測蛋白變化。應用SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，75 V、70 min 濕轉至0.22 μm 的硝酸纖維素薄膜上，隨后用含5%脫脂乳的TBS/T 緩沖液封閉2 h，用TNF-α、β-Actin 一抗4 ℃過夜孵育，TBS/T 清洗后，二抗37 ℃孵育1 h，TBS/T 清洗后，用發光液顯色，蛋白條帶用曝光機捕獲。

1.4 添加LPS 對奶牛乳腺上皮細胞miR-223 表達的影響

同上，6 孔板細胞密度達80%時，加入含有LPS 終濃度為1 μg/mL 的細胞培養液，同時建立不加LPS 的對照組。培養24 h 后采用TRIzol 法提各組總RNA，應用染料法Hairpin-it miRNAs qRT-PCR 定量試劑盒檢測miR-223 的相對表達量。引物如表1 所示。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.5 奶牛乳腺上皮細胞轉染miR-223 mimics

將DCMECs 傳于6 孔板，細胞融合至80%左右時，加入無血清無雙抗培養液，使用Lipo2000 脂質體轉染試劑轉染miR-223。miR-223 處理組：6 μL Lipo2000、70 nmol/L miR-223 mimics；miR-223 陰性對照組：6 μL Lipo2000、70 nmol/L mimics NC。轉染6 h后，更換帶血清及雙抗的完全培養液。轉染24 h 后，同上述方法提總RNA，應用qRT-PCR 檢測miR-223的相對表達量。

1.6 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 相關蛋白表達的影響

同上，將細胞接種6 孔板中，細胞融合密度達80%左右時轉染miR-223 處理組、陰性對照組，轉染24 h 后分別加入LPS 終濃度為1 μg/mL 的細胞培養液，同時建立不添加LPS 的空白對照組，37 ℃繼續培養24 h，Western blot 檢測TNF-α、FASN 蛋白表達變化。

1.7 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 凋亡的影響

同上，6 孔板細胞轉染miR-223 mimics 與mimics NC，添加LPS 刺激24 h 后，按照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書，應用原位熒光檢測貼壁細胞凋亡情況。

1.8 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 乳脂合成的影響

同上，6 孔板細胞轉染miR-223，LPS 刺激24 h后，PBS 清洗2 次，4 %多聚甲醛固定30 min，PBS 清洗后用1 μg/mL 的Nile Red 工作液37 ℃避光孵育15 min，PBS 清洗后用DAPI 染核，置于熒光顯微鏡觀察。

1.9 數據分析

蛋白條帶和原位熒光圖應用Image J 軟件分別掃描灰度值與熒光強度。原始數據使用SPSS 軟件進行差異分析，數據以平均數±標準差（x±s）表示，樣本間差異性比較進行t檢驗或方差分析，使用GraphPad Prism 8 軟件作圖，“ns”表示無統計學差異（P＞0.05），“**”表示有極顯著統計學差異（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養與鑒定結果

如圖1 所示，圖(a)為倒置顯微鏡下培養5 d 后的原代DCMECs，底部附著組織團塊，且貼壁細胞大多數為放射狀的成纖維細胞。圖(b)為經胰酶純化后的DCMECs，呈多角形、鵝卵石狀緊密排列的上皮細胞。將純化后的DCMECs 采用免疫熒光技術對其進行CK-18 的鑒定，如圖2 所示，藍色橢圓形為DAPI 染色的細胞核，綠色拉網狀的為FITC 標記的CK-18 蛋白。由此可知，已成功獲得純的DCMECs。

圖1 DCMECs 的原代培養與純化

圖2 DCMECs CK-18的鑒定

2.2 添加LPS 對奶牛乳腺上皮細胞炎癥蛋白因子的影響

分別用不同濃度（0.1、1、10 μg/mL）的LPS 處理DCMECs，24 h 后應用Western blot 檢測細胞炎癥蛋白因子TNF-α 的表達情況。結果如圖3 所示，與空白對照組相比，LPS 促進了TNF-α 的表達。與0.1 μg/mL處理組相比，1 μg/mL 處理組TNF-α 表達顯著上調（P＜0.01）。10 μg/mL 處理組與1 μg/mL 處理組相比，TNF-α 表達有所上調，但無統計學差異（P＞0.05）。由此可得，1 μg/mL 的LPS 為誘導DCMECs 炎癥反應的最佳濃度，后續采用濃度1 μg/mL 的LPS 進行炎癥造模探究。

圖3 LPS 對DCMECs 炎癥蛋白因子的影響

2.3 添加LPS 對奶牛乳腺上皮細胞miR-223 表達的影響

用濃度為1 μg/mL 的LPS 處理DCMECs，24 h后提取細胞總RNA，應用qRT-PCR 檢測miR-223表達情況。如圖4 所示，經LPS 誘導的DCMECs miR-223表達顯著上調（P＜0.01）。結果表明，LPS 可促進DCMECs miR-223 的表達。

圖4 LPS 對奶牛乳腺上皮細胞miR-223 表達的影響

2.4 轉染miR-223 mimics 對miR-223 表達的影響

將miR-223 mimics 與mimics NC 分別轉染至細胞，24 h 后應用qRT-PCR 檢測miR-223 表達情況。如圖5 所示，miR-223 過表達后，較陰性對照組上調約400 倍。結果表明，miR-223 成功轉染至細胞中，且轉染效率顯著（P＜0.01）。

圖5 轉染miR-223 mimics 對miR-223 表達的影響

2.5 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 相關蛋白表達的影響

將miR-223 mimics 與mimics NC 分別轉染至細胞24 h 后，吸棄培養液，分別添加1 μg/mL 的LPS 繼續培養24 h 后，應用Western blot 檢測細胞炎癥蛋白因子TNF-α 與乳脂合成相關蛋白FASN 的表達情況。如圖6 所示，與空白對照組相比，LPS 處理下TNF-α 表達顯著上調，FASN 表達顯著下調（P＜0.01）。轉染miR-223 mimics+LPS 組與mimics NC+LPS 組相比，TNF-α 表達顯著下調，FASN 表達顯著上調（P＜0.01）。結果表明，miR-223 過表達可以顯著抑制LPS 誘導的DCMECs 炎性因子TNF-α 并促進乳脂合成相關蛋白FASN 的表達。

圖6 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 相關蛋白表達的影響

2.6 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 凋亡的影響

同上，將miR-223 轉染至細胞24 h 后分別添加1 μg/mL 的LPS 再繼續培養24 h 后，應用原位熒光檢測細胞凋亡情況。如圖7 所示，綠光為FITC 標記的凋亡細胞，紅光為PI 標記的壞死細胞的細胞核。與空白對照組相比，LPS 組凋亡細胞數明顯增多，而轉染miR-223 mimics+LPS 組與mimics NC+LPS 組相比，細胞凋亡數顯著減少。結果表明，miR-223 過表達可以顯著抑制LPS 誘導的DCMECs 凋亡。

圖7 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 凋亡的影響

2.7 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 乳脂合成的影響

同上，轉染后添加1 μg/mL 的LPS 再繼續培養24 h 后，應用Nile Red 染色，熒光顯微鏡觀察細胞內甘油三酯合成情況。如圖8 所示，與空白對照組相比，LPS 組甘油三酯含量顯著下調（P＜0.01），而轉染miR-223 mimics+LPS 組與mimics NC+LPS 組相比，細胞內甘油三酯含量顯著上調（P＜0.01）。結果表明，miR-223 過表達可以顯著上調LPS 誘導的DCMECs內甘油三酯含量，促進乳脂合成。

圖8 miR-223 過表達對LPS 誘導的DCMECs 乳脂合成的影響

3 討 論

奶牛乳腺炎可分為亞臨床和臨床乳腺炎，在我國發病率約為46%～70%[20]，而亞臨床乳腺炎通常癥狀不明顯，使其易于在牛群中傳播，對產乳量和乳品質造成很大影響[21-22]。對此大量研究通過使用滅活的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌構建乳腺炎模型，應用RNASeq 技術分析牛乳腺上皮細胞的miRNAs 的差異表達[23-24]。如LI R 等[25]通過對比葡萄球菌感染的乳腺組織發現有77 個miRNAs 的表達量有顯著差異：miR-223、miR-132、miR-184、miR-1246 與miR-130b 表達上調，而miR-205、miR-200b、miR-196a、miR-145與miR-31 表達下調。SUGATANI T 等[26]發現LPS 刺激小鼠支氣管和肺泡上皮細胞后的miR-223 表達上調。ZHAO G 等[16]也發現LPS 誘導的子宮內膜炎中NF-κB 的活化促進了miR-223 的轉錄，從而抑制了其靶基因NLRP3 介導炎癥介質的激活，來保護子宮免受炎癥損傷。本研究發現，應用LPS 誘導DCMECs構建的奶牛乳腺炎細胞模型與對照組相比miR-223的表達上調3 倍左右，這恰與上述前人的研究結論相符，可知miR-223 參與了LPS 誘導的DCMECs 炎癥的發展，具有很高的研究價值。

關于miR-223 在炎癥性疾病方面發揮機制的研究，ZHANG L 等[10]發現在人乳腺癌細胞中，miR-223-3p 誘導NLRP3 炎癥小體失活，抑制腫瘤生長，增強抗癌免疫。ZHOU W 等[27]表明，吞噬細胞和上皮細胞中的miR-223 通過抑制典型的NF-κB 通路共同限制炎癥的程度。眾多研究證明在巨噬細胞中，miR-223 可負調節NF-κB 活化并下調促炎因子（NF-κB、IL-1β 和IL-6 等）的表達，從而可減輕骨骼肌損傷的慢性炎癥反應的發展[9,28-29]。同樣LIAN F 等[30]發現在大鼠海馬神經元細胞中，miR-223-3p 負調節FOXO1 以抑制炎癥因子的表達。因此，miR-223 常被作為一種抗炎的miRNA。在本研究中，我們發現miR-223的過表達可下調LPS 誘導誘導的炎癥因子TNF-α的表達，并降低細胞凋亡比率，從而減緩DCMECs 炎癥反應的發展。然而也有研究表明，在真菌性角膜炎中沉默miR-223-3p 的表達可以通過靶向自噬相關16 樣蛋白1（ATG16L1）來促進自噬和緩解炎癥[31]。提示miR-223 對炎癥性疾病的作用與其在不同狀態細胞下的多功能性和抑制不同的靶基因有關。總之，在本研究中發現LPS 刺激DCMECs 可使miR-223 的表達上調，通過篩選出LPS 構建乳腺炎模型的最佳濃度后，發現過表達miR-223 可抑制LPS 誘導的炎癥因子TNF-α 的產生，減輕細胞凋亡，促進LPS 誘導的乳脂合成相關蛋白FASN 的表達，恢復LPS 破壞的乳脂合成能力，對LPS 誘導的DCMECs 具有正向調節作用。而miR-223 的作用機制是否是通過以往研究發現的靶點（FOXO 家族、Rho 家族、NF-κB 及NLRP3 等）發揮作用，還需要進一步深入探究。

4 結 論

1 μg/mL 的LPS 為誘導DCMECs 炎癥反應的最佳濃度，LPS 刺激DCMECs 可促進miR-223 的表達，miR-223 過表達能夠抑制LPS 誘導的DCMECs 炎癥因子TNF-α 的表達，減輕LPS 誘導的DCMECs 凋亡反應，促進LPS 誘導的DCMECs 乳脂合成相關蛋白FASN 的表達及乳脂合成，提示miR-223 在DCMECs 中具有抵抗LPS 誘導的炎癥反應的作用。