微生物檢驗過程中微濾膜分離技術(shù)的應(yīng)用價值

李新紅 李忠

微生物檢驗是疾病預(yù)防控制中心（簡稱疾控中心）日常工作之一，疾控中心通過各種現(xiàn)代化的實驗室設(shè)備和技術(shù)，對各種微生物特別是病原微生物進行鑒定、檢測和分析，可以為感染性疾病防控及相關(guān)突發(fā)公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處理提供重要依據(jù)，是創(chuàng)造安全環(huán)境、保護公眾健康的重要手段[1]。微生物檢驗項目眾多，在細(xì)菌總數(shù)測定方面，平板計數(shù)法是國標(biāo)規(guī)定的檢測方法，此法精準(zhǔn)度高，但是微生物培養(yǎng)時間長，因此檢驗耗時久，檢驗效率不高，難以滿足疾病預(yù)防控制中心實際工作需要[2]。對此，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量微生物快速檢驗方法的研究，力求保證檢驗高精準(zhǔn)度的同時，簡化檢驗程序，縮短檢驗時間，提高檢驗速度和效率。膜分離技術(shù)是在分子水平上將不同粒徑的混合物通過具有一定孔徑的半透膜，從而實現(xiàn)不同粒徑混合物的選擇性分離，依據(jù)半透膜孔徑大小可以分為微濾膜、超濾膜、納濾膜等多種技術(shù)類型[3]。其中，微濾膜分離技術(shù)所用過濾膜的過濾孔徑在0.1～1.0 μm，不僅可以截留懸浮物和大尺寸膠體，亦可截留細(xì)菌及部分病毒，因此不僅在食品生產(chǎn)處理、污廢水處理、海水淡化等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，近年也在實驗室標(biāo)本微生物分離與檢驗中得到推廣[4]。文章現(xiàn)以濟南市疾病預(yù)防控制中心近年接收的86 份微生物待檢樣本為例，以平板計數(shù)法為對照，探討微濾膜分離技術(shù)在微生物檢驗中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2022 年1 月—2023 年6 月濟南市疾病預(yù)防控制中心接收的86 份微生物待檢樣本為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）待檢樣本的量充足（≥20 mL），可以同時滿足2 種微生物檢驗方法的檢驗需要，樣本類型不限。（2）樣本采集規(guī)范，封閉送檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）疑似污染樣本。（2）檢驗數(shù)據(jù)資料不全。待檢樣本類型：生活飲用水樣本35 份，血液樣本21 份，食品樣本17 份，污水樣本9 份，其他4 份。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)備與材料

醫(yī)用YB-MDX23 型膜式電動吸引器（上海醫(yī)療器械產(chǎn)業(yè)公司）；STV3 無菌薄膜過濾器（浙江寧海白石藥檢儀器廠）；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；OLYMPUS BX53 三目顯微鏡（奧林巴斯光學(xué)技術(shù)公司）；φ50 mm×0.45 μm 的微孔濾膜（上海新亞凈化器件廠）；HealForce B2 型生物安全柜（力康醫(yī)療器械科技有限公司）；BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司）；計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（恒凱生物科技有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)有限公司）；J-HH-4A 型精密恒溫水浴鍋（冠森生物科技）；500 mL 無菌錐形瓶（賽默飛世爾科技有限公司）；90 mm 無菌培養(yǎng)皿（上海晶安生物科技有限公司）；綠膿桿菌ATCC9027，大腸桿菌ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC6538，陰溝腸桿菌CMCC45301，均由中國藥品生物制品檢定所提供。培養(yǎng)液：蛋白胨10 g+牛肉膏粉3 g+氯化鈉0.05 g+氯代三苯基四氮唑0.01 g+1 000 mL 蒸餾水，充分溶解后調(diào)整酸堿值至（7.5±0.1），脫脂棉球過濾后120℃滅菌20 min 備用。生理鹽水為氯化鈉8.5 g+1 000 mL 蒸餾水，脫氯劑為硫代硫酸鈉1.8 g+100 mL 蒸餾水，滅菌方法同培養(yǎng)液。

1.2.2 實驗方法

從每份待檢樣本中各取10 mL 以平板計數(shù)法進行微生物檢驗，另各取10 mL 基于微濾膜分離技術(shù)獲取菌細(xì)胞進行微生物檢驗。

平板計數(shù)法檢驗方法：檢驗操作嚴(yán)格遵照國家標(biāo)準(zhǔn)進行，將待檢樣本置于培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫下孵育24～48 h，顯微鏡下觀察有無菌落分布并統(tǒng)計細(xì)菌計數(shù)，檢驗結(jié)果以CFU/mL 為單位報告[4]。

微濾膜分離技術(shù)檢驗方法：吸取1 mL 待檢樣本置于99 mL 無菌蒸餾水中，配置成含菌濃度＜100 CFU/100 mL的樣本備用。取不銹鋼過濾裝置，預(yù)先高溫灼燒，充分滅菌，然后夾取無菌的微孔濾膜置于過濾頭上并正確安裝濾杯。將100 mL 稀釋后的待檢樣品搖勻并加入濾杯中，以真空泵抽濾至全部液體通過濾膜，然后加入100 mL 無菌生理鹽水2 次抽濾至全部液體濾完，關(guān)閉開關(guān)。輕夾微孔濾膜邊緣，正面朝上緩慢移至培養(yǎng)基上，要保證濾膜與培養(yǎng)基之間完全貼緊，無褶皺、卷邊及氣泡夾留。蓋好皿蓋，放入恒溫箱內(nèi)37℃恒溫下孵育15～24 h，顯微鏡下觀察有無菌落分布并統(tǒng)計細(xì)菌計數(shù)。基于微濾膜分離技術(shù)的微生物檢驗全過程于潔凈工作臺進行，嚴(yán)格遵循無菌化原則，所用儀器和濾膜均高壓滅菌，全程質(zhì)量控制，另設(shè)空白濾膜作為陰性對照，以保證檢驗方法的可靠性。細(xì)菌計數(shù)采用公式Q ＝F/G 進行計算，式中F 為全部菌落數(shù)，G 為過濾樣本量，Q 為每1 mL 樣本中的細(xì)菌總數(shù)，樣本稀釋則乘以稀釋倍數(shù)。

初檢完成后進行確認(rèn)實驗，將2 種檢驗方法第1 次檢測確認(rèn)的陽性樣本直接接種到培養(yǎng)液中，劃出典型菌落，再以培養(yǎng)基同法培養(yǎng)后，以AP120E 標(biāo)準(zhǔn)進行鑒定，同時對2 種方法檢驗結(jié)果不一致的樣本重新進行檢驗。確認(rèn)試驗主要是2 次復(fù)檢第1 次檢測的陽性結(jié)果是否存在假陽性情況以及2 種檢驗是否存在假陰性情況，2 次檢驗結(jié)果一致判定為真陽性或真陰性，2 次檢驗結(jié)果不符則再次復(fù)檢，以3 次檢驗中2 次相同的檢驗結(jié)果為最終檢驗結(jié)果。

另外，從2 種方法檢驗結(jié)果為陽性的樣本中隨機抽樣進行回收率實驗。從培養(yǎng)基斜面上取1 mL 新鮮培養(yǎng)的陽性菌，加入9 mL 生理鹽水中充分振蕩搖勻，取1 mL 菌懸液再次加入9 mL 生理鹽水中，得到濃度30～300 CFU/mL 的活性菌懸液。另以樣品替代生理鹽水，加陽性菌同法制作樣液，稀釋度與菌懸液相同。采用活菌計數(shù)實驗，分別取1 mL 菌懸液和1 mL 樣液，37℃恒溫孵育48 h 后計數(shù)，分別記為A 和B。以公式C ＝（A-B）/A×100%計算回收率。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較平板計數(shù)法與微濾膜分離技術(shù)的微生物檢出率。（2）比較平板計數(shù)法與微濾膜分離技術(shù)檢驗微生物的出報告時間。出報告時間從樣本開始進行前處理起算。（3）比較平板計數(shù)法與微濾膜分離技術(shù)的活菌回收率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本均數(shù)t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 種檢驗方法的微生物檢出率比較

將平板計數(shù)法與微濾膜分離技術(shù)對86 份樣本的細(xì)菌總數(shù)檢驗結(jié)果進行配對實驗，2 種方法共檢出陽性樣本47 份，其中微濾膜分離技術(shù)檢出45 份，占比為95.74%，平板計數(shù)法檢出陽性樣本47 份，占比為100%。47 份樣本中，2種方法共同檢出陽性45 份，平板計數(shù)法單獨檢出2 份，微濾膜分離技術(shù)未單獨檢出陽性樣本。2 種方法初檢86 份樣本的陽性檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），2例平板計數(shù)法檢驗陽性的樣本經(jīng)微濾膜分離技術(shù)復(fù)檢均明確陽性，基于復(fù)檢結(jié)果，微濾膜分離技術(shù)初診漏檢2 例，2種方法的復(fù)檢陽性率與漏檢率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、表2。

表1 2 種檢驗方法初檢的配對實驗結(jié)果（n ＝86）

表2 2 種檢驗方法的初檢與復(fù)檢結(jié)果比較[份（%）]

2.2 2 種檢驗方法出報告時間比較

平板計數(shù)法的培養(yǎng)時間為24～48 h，平均培養(yǎng)時間（32.75±4.36）h ；微濾膜分離技術(shù)的培養(yǎng)時間為15～24 h，細(xì)菌培養(yǎng)過程中通過觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)達(dá)到24 h 時菌落即可清晰計數(shù)，延長培養(yǎng)時間至48 h，未見更多菌落生長，平均培養(yǎng)時間（20.24±3.17）h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝21.521，P＜0.001）。

2.3 2 種檢驗方法的活菌回收率比較

微濾膜分離技術(shù)的陽性菌回收率總體高于平板計數(shù)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 2 種檢驗方法的陽性菌回收率比較

3 討論

微濾膜分離技術(shù)以靜壓差為推動力進行膜篩分，可以從氣相和液相的物質(zhì)中去除和截留各種直徑大于半透膜孔徑的物質(zhì)，從而實現(xiàn)分離、凈化和濃縮[5]。技術(shù)優(yōu)點：孔徑均勻，過濾精度高，可以全部截留大于孔徑的微粒；孔密度高，膜阻力小，孔體積占膜體積的70%以上，過濾速度快；孔膜厚度不超過150 μm，吸附量極少；微濾膜為高分子材料，不會有脫落介質(zhì)，過濾純度高[6]。

文章體現(xiàn)了《臨床微生物學(xué)檢驗過程的生物安全風(fēng)險管理專家共識》[7]的臨床參考，分別以微濾膜分離技術(shù)和平板計數(shù)法對86 份待檢樣本進行微生物檢驗，2 種方法共檢出陽性樣本47 份，根據(jù)復(fù)檢結(jié)果微濾膜分離技術(shù)初診漏檢2 例，2 種方法的初檢與復(fù)檢陽性率以及漏檢率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示2 種方法用于微生物檢驗的效果相當(dāng)。微濾膜分離技術(shù)可以通過膜篩分截留樣本中的菌細(xì)胞，然后再通過實驗室方法培養(yǎng)和檢驗，直徑大于半透膜孔徑的菌細(xì)胞均可以通過微濾膜分離技術(shù)獲取到，因此檢驗的敏感性與準(zhǔn)確性很高，根據(jù)本研究結(jié)果是可以替代平板計數(shù)法使用的[8]。有研究分別以平板計數(shù)法和微濾膜分離技術(shù)進行微生物檢驗，結(jié)果顯示陽性檢出率分別為98.15%和94.37%，檢驗敏感度分別為97.89%和92.10%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）[9]。另有學(xué)者分別以濾膜法、多管發(fā)酵法和酶底物法檢測水體中的總大腸菌，結(jié)果顯示濾膜法與多管發(fā)酵法均準(zhǔn)確檢出陽性菌，酶底物法假陽性1 例[10]。由此可見，微濾膜分離技術(shù)用于微生物檢驗的陽性檢出率高，與本研究結(jié)論相符。另外，微濾膜分離技術(shù)所用濾膜為單片無菌包裝，檢驗時可直接取用，不僅可以節(jié)省滅菌時間，還能避免和減少2 次污染所致假陽性問題，更符合認(rèn)證規(guī)范[11]。不過，由于微濾膜的孔徑十分微小，如果待檢樣本中大尺寸懸浮微粒的量較大或是含有毒素成分，則可能影響微生物的正常培育，從而導(dǎo)致檢驗結(jié)果不準(zhǔn)確[12]。

出報告時間方面，本研究中微濾膜分離技術(shù)的平均培養(yǎng)時間（20.24±3.17）h，短于平板計數(shù)法（32.75±4.36）h，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與文獻報道結(jié)論相符[13]。可見微濾膜分離技術(shù)的培養(yǎng)時間更短，微生物檢驗出報告更快。通常情況下，平板計數(shù)法的微生物培養(yǎng)時間在24～48 h，而基于微濾膜分離技術(shù)的微生物培養(yǎng)只需要15～24 h 就能讓菌落生長完全，此時即可清晰計數(shù)，延長培養(yǎng)時間并不會有更多的菌落生長。這主要是因為基于微濾膜分離技術(shù)自帶濃縮效應(yīng)，濾膜上的菌量高，生長與增殖更快，因此檢驗時間被大大縮短，檢驗效率得到提升，這對于及時發(fā)現(xiàn)待檢樣本中的致病微生物、保障民眾健康具有重要價值[14]。另外，以平板計數(shù)法進行微生物培養(yǎng)時，有些菌落埋藏在培養(yǎng)基內(nèi)，計數(shù)困難，也影響檢驗效率。而使用微濾膜分離技術(shù)進行檢驗時，菌落直接在濾膜上培育生長，菌落個大良好，易于計數(shù)，也在一定時間上縮短了檢驗時間。

此外，本研究中微濾膜分離技術(shù)的陽性菌回收率總體上也高于平板計數(shù)法，與文獻報道結(jié)論相符[15]。提示前者能更加真實地反映微生物對樣本的污染程度，不過需要注意的是，如果在微濾膜分離技術(shù)中濃度過大的菌懸液，過量的菌細(xì)胞聚集在濾膜上，也會給微生物培養(yǎng)生長和計數(shù)造成困難，有導(dǎo)致回收率降低的可能。因此，應(yīng)用微濾膜分離技術(shù)需要控制樣本的稀釋度，一般宜選擇活性菌濃度稀釋在30～300 CFU/mL 的菌懸液，以保證檢驗效果。

綜上所述，微生物檢驗中應(yīng)用微濾膜分離技術(shù)的陽性檢出率與平板計數(shù)法相當(dāng)，但前者的培養(yǎng)時間更短，微生物檢驗出報告時間早，陽性菌回收率更高，效果優(yōu)于平板計數(shù)法，有助于提高檢驗效率，更真實地反映樣品的微生物污染程度。