microRNA-145對癲癇細胞炎癥反應的影響

樊麗霞 蔣小玲

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，其特征性表現為癲癇發作，發作形式多種多樣，可表現為短暫性運動、感覺、意識和自主神經等功能障礙，最明顯的發作形式為強直-陣攣發作。癲癇發作給患者生理方面造成極大痛苦，并因病恥感影響其生理方面。目前治療癲癇的目的是抑制神經元的異常放電，以控制癲癇發作的起始和進展。目前抗癲癇發作藥物已被廣泛應用，且抗癲癇發作藥物已更新至第3 代，但約1/3 的患者仍發展為難治性癲癇，這意味著當前的藥物未能控制這些患者的癲癇發作，部分患者可以進行各種手術治療，但一些患者的術后結果仍不理想[1-3]。就目前的情況而言，有必要探索癲癇發生的新機制，開發新的治療靶點。盡管癲癇的細胞和分子機制尚不完全清楚，但近年來，越來越多的證據表明，炎癥在癲癇發病機制中起著重要作用，且抗炎可以減少癲癇發作[4-5]。miR 是一類內源性的非編碼小分子RNA，主要通過與靶mRNA 的相互作用對特定基因表達進行負調控，導致其降解或抑制其翻譯，從而導致細胞中的蛋白質水平總體較低；近年來，miRNA 在癲癇發病機制中的作用是一個快速擴展的研究領域[6]。據報道已觀察到miRNA-134、miRNA-181a 和miRNA-146a 等在癲癇患者中的改變[7]。miR-145 可參與多種疾病的發生發展，研究發現骨髓間充質干細胞通過miR-145 抑制缺氧條件下A549 肺癌細胞的惡性行為，miR-145 通過直接靶向成纖維細胞中的SOX9 通過AKT/GSK-3β/β-連環蛋白信號通路減輕心臟纖維化[8-9]。但目前有關miR-145 在癲癇中研究報道較少，尤其在癲癇炎癥反應中的影響鮮有報道。本研究通過體外建立癲癇細胞模型，旨在探討miR-145 對癲癇細胞炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

CTX-TNA 星形膠質細胞購自LMAI Bio 公司；高糖達爾伯克改良伊格爾（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）培養基購自Hyclone、OPTI-MEM 培養液、胎牛血清購自GIBCO 公司；Lipo2000 購自Invitrogen 公司；Trizol試劑、miR-145 模擬物（miR-145 mimics）、miR-145 抑制劑（miR-145 inhibitor）、cDNA 反轉錄試劑盒購自賽默飛科技有限公司；CCK8 試劑盒購自abcam 公司；胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%）、青霉素鏈霉素（雙抗）購自北京索萊寶科技有限公司；Dual-Luciferase 報告基因檢測系統檢測試劑盒購自Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及癲癇細胞模型建立

CTX-TNA2 細胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培養液（含D-葡萄糖4.5 g/L、碳酸氫鈉3.4 g/L、L-谷氨酰胺584 mg/L、青霉素75 mg/L、鏈霉素100 mg/L），為了建立癲癇樣活性，將細胞置于37℃，含有5%CO2的CO2孵育箱中，在95%濕度條件下培養，并用10 ng 白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）持續處理24 h。

1.2.2 分組

將經IL-1β 處理過的CTX-TNA2 細胞接種于6 孔板中，共3 個復孔，每孔加入2 mL 的細胞懸液。細胞隨機分 為5 組：NC 組、inhibitor NC 組、miR-145 inhibitor 組、mimics NC 組、miR-145 mimics 組。用miR-145inhibitor 沉默了miR-145，而用miR-145 mimics 在CTX-TNA 細胞中過表達dmiR-145。用150 μL 基本培養基稀釋Lipo2000，溫和混勻并于37 ℃孵育5 min，用150 μL 基本培養液分別稀釋10 μL miR-145 mimics、無義序列mimics、無義序列inhibitor、miR-145 inhibitor，溫和混勻，隨后在室溫下孵育20 min，將混合液加入各孔中，置于37 ℃、含有5%CO2、常規濕度的培養箱中培養48 h。

1.2.3 CCK8 檢測細胞活性

將CTX-TNA 細胞（4×103個細胞/孔）鋪在96 孔板中生長24 h。除去培養基，并將CCK-8 溶液加入培養基中，使用酶標儀在490 nm 處測量光密度（optical density，OD）值，OD 值越大，細胞活力越強。

1.2.4 酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）實驗

收集各組細胞上清液，檢測細胞上清液中炎癥因子白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的水平，操作按照ELISA 試劑盒說明書進行。繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.2.5 定量即時聚合酶鏈鎖反應（quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR）

使用Trizol 試劑從NC 組以及其他實驗組細胞中分離總RNA。通過使用cDNA 反轉錄試劑盒對總RNA 進行反轉錄后獲得cDNA。RT-qPCR 在7900HT Fast Real-Time PCR System 上操作，實時聚合酶鏈鎖反應（polymerase chain reaction，PCR）系統測量炎癥細胞因子IL-2、IL-6、TNF-α 的表達水平，以GAPDH 內參，引物序列見表1。各組mRNA 的相對表達量通過2-ΔΔCt進行分析。

表1 RT-qPCR 引物列表

1.3 統計學處理

采用SPSS 19.0 統計學軟件對數據進行分析。計量資料以（）表示，多組間比較采用One-Way ANONA 分析和多重分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞炎癥因子IL-2、IL-6、TNF-α 的mRNA和蛋白表達

與NC 組、miR-145 mimics 組比較，miR-145 inhibitor組IL-2、IL-6、TNF-α mRNA、蛋白水平均降低（P＜0.01）；與NC 組、miR-145 inhibitor 組比較，miR-145 mimics 組蛋白、mRNA 水平均升高（P＜0.01）。見圖1、表2。

圖1 各組炎癥因子mRNA 的相對表達。①與NC 組比較，③與miR-145inhibitor 組比較，⑤與miR-145 mimics 組比較，P ＜0.001。

表2 各組炎癥因子的蛋白表達（n ＝3，）

表2 各組炎癥因子的蛋白表達（n ＝3，）

注：①與NC 組比較，②與inhibitor NC 組比較，③與miR-145 inhibitor 組比較，④與mimics NC 組比較，⑤與miR-145 mimics 組比較，P ＜0.001。

2.2 各組細胞活力檢測結果

在12、24、48 h，與NC 組、miR-145 inhibitor 組比較，miR-145 mimics 組細胞活力均下降（P＜0.01）；與NC 組、miR-145 mimics 組比較，miR-145 inhibitor 組細胞活力均升高（P＜0.01）。見圖2、表3。

圖2 各組細胞活力。①與NC 組比較，③與miR-145 inhibitor 組比較，⑤與miR-145 mimics 組比較，P ＜0.001。

表3 各組細胞活力（n ＝3，）

表3 各組細胞活力（n ＝3，）

注：①與NC 組比較，②與inhibitor NC 組比較，③與miR-145 inhibitor 組比較，④與mimics NC 組比較，⑤與miR-145 mimics 組比較，P ＜0.001。

3 討論

癲癇一直是位列世界衛生組織（World Health Organization，WHO）重點防治的五大神經精神疾病之一，據WHO 2018 年發布的實況報道，全世界目前有約5 000 萬的癲癇患者，據估計我國有高達1 000 萬以上的人群受累，同時每年有60 萬左右新發癲癇患者，年經濟負擔超過200 億人民幣。癲癇的病因包括基因突變、急性腦損傷（如中風、創傷、腦腫瘤或癲癇）、中樞神經系統（central nervous system，CNS）感染、自身免疫性疾病和代謝紊亂[10]。然而，對于許多患者來說，癲癇的病因尚不清楚。此外，癲癇最常與神經系統并發癥相關，即認知功能障礙、抑郁和焦慮以及精神疾病，包括孤獨癥譜系障礙，嚴重影響患者的生活質量。但當前的藥物未能控制大約1/3 的患者，并發展為難治性癲癇[1]。近年來，在癲癇發病機制方面取得了一些進展，包括形態學改變、轉錄組調控、表觀調控和分子信號通路，但由于癲癇的復雜性，其發病機制仍不十分清楚，這是癲癇極難治愈的主要原因[11]。因此，對癲癇發生機制的深入認識，對開發新的癲癇治療方法具有重要意義。

越來越多的證據表明，炎癥在癲癇發病機制中起著重要作用，癲癇發生與腦組織中升高的、嚴重的和慢性的炎癥狀況有關，伴隨著神經元損傷和膠質增生[2-3]。炎癥反應失調可能導致神經連接異常和神經網絡興奮過度，促進癲癇的發生和發展，癲癇活動期間腦細胞分泌的炎癥介質，如細胞因子、趨化因子和前列腺素，不僅會促進炎癥，而且會作為神經調節劑影響神經元功能[10]。炎癥因子可影響神經元和神經膠質細胞的電活動細胞，除了引起局部炎癥反應，同時癲癇發作也會引起神經炎癥反應，進一步加重神經細胞損傷，從而形成惡性循環，通過不同途徑抑制炎癥小體復合物成分的特異性抑制劑，或其他天然和化學藥物可改善癲癇癥狀。研究表明，IL-1β 及TNF-α 等與癲癇有關，IL-1β 的表達與癲癇的嚴重程度相關[12]。IL-1β由多種細胞產生和分泌，在癲癇持續狀態的急性期和自發癲癇發作的慢性期，IL-1β 在活化的小膠質細胞和星形膠質細胞中被強烈誘導，主要由星形膠質細胞維持。有研究發現，IL-1β 能促進癲癇發生[13]。IL-2 可促進神經及膠質細胞生長的作用，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）具有促進細胞增殖和分化的作用，國內有學者推測，IL-2、TNF-α 可能參與了所有癲癇類型的發生與發展[14]。然而，癲癇的炎癥調控機制尚不完全清楚。

許多研究提示星形膠質細胞功能障礙促進癲癇的發展和進展，星形膠質細胞在癲癇的發病機制中起著關鍵作用[15]。由于新生大鼠皮層提供了豐富的星形膠質細胞，CTX-TNA2 細胞已被用于建立癲癇的細胞模型[16]。雖然原代星形膠質細胞可能是一個更好的選擇，但因其很難分離和培養，且需要對其進行鑒定；一致性不如足夠好的細胞系；細胞壽命有限，很難轉染[17]。因此，選擇CTX-TNA2 細胞作為本研究的模型。此外，IL-1β 誘導的炎癥是癲癇發病的一個關鍵因素。基于這些證據，本研究認為用IL-1β 處理的CTX-TNA2 細胞可以作為研究癲癇的體外模型。

眾所周知，miRNA 可通過與靶基因的特定序列互補，在轉錄后水平調節靶基因的表達，并參與一些生命過程，如生物生長發育、細胞增殖分化、致癌、凋亡和脂質代謝能夠，調節多種疾病的信號通路，目前發現已成為癲癇病因和發展的關鍵因素[18]。有研究發現，下調miR-145 通過調節海馬神經元凋亡提高癲癇大鼠學習記憶能力[19-22]。本研究證明了在IL-1β 處理的CTX-TNA2 癲癇細胞模型中，抑制miR-145 可降低IL-2、IL-6、TNF-α 的mRNA 及蛋白表達，提高了癲癇細胞的生存能力。

miRNA-145 對炎癥反應的影響有助于闡明癲癇的發病機制。在這項研究中，證明抑制miR-145 抑制癲癇的炎癥反應、提高了癲癇細胞的生存能力，但其上下游的調控機制有待進一步研究。本研究中的所有數據均來自體外試驗，但計劃將在體內進行進一步的研究，以驗證癲癇的調節機制，為癲癇患者的治療策略提供新的靶點。

綜上所述，癲癇是神經系統常見疾病之一，癲癇發作嚴重影響患者的身心健康，目前有1/3 患者為藥物難治性癲癇，因此開發新的治療靶點至關重要。但因癲癇的復雜性，癲癇病因機制目前尚未完全清楚，越來越多的研究已經證實炎癥在癲癇的發病機制中起著重要作用，促進癲癇的發生與發展，且與癲癇互為因果，本研究證實，在體外實驗中抑制miR-145 抑制癲癇的炎癥反應，可能為癲癇治療提供新的方向。