毛酸漿內(nèi)酯通過(guò)抑制STAT3誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡*

韓紅葉，余雅琴，張強(qiáng)，孫雨頡，康寧

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，天津 301617；3.武漢市黃陂區(qū)人民醫(yī)院腫瘤科，武漢 430300）

乳腺癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居首位，中國(guó)乳腺癌發(fā)病率逐年攀升，嚴(yán)重危害女性健康[1]。目前，常用的化療藥物在有效殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生了較大的殺傷作用，由此引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，進(jìn)而限制其在臨床上的使用[2]。中藥在有效治療腫瘤的同時(shí)還能夠改善身體機(jī)能，提高患者生存質(zhì)量，這種治療作用逐漸得到臨床專家的認(rèn)可[3]。因此，從中藥及其活性成分中開發(fā)治療乳腺癌的藥物成為可能。乳腺癌在中醫(yī)古代文獻(xiàn)中的記載歸屬于“乳石癰”“乳巖”“乳栗”等范疇[4]，其發(fā)病病機(jī)與乳腺癌患者癌毒壅結(jié)乳房及痰瘀熱毒、肝經(jīng)郁火、癌毒走注等邪實(shí)證候密切相關(guān)[5]。因此，乳腺癌的治療以具有清熱解毒、活血化瘀、化痰散結(jié)功效的藥物為主。

毛酸漿（PhysalispubescensL.）又稱“洋姑娘”“姑蔦”“姑娘果”和“菇娘兒”，是茄科酸漿屬的1年生草本植物，具有清熱解毒、化痰利咽、利尿通淋等功效[6]，作為藥食兩用的中藥材具有重要研究?jī)r(jià)值。毛酸漿內(nèi)酯（PPB）是從毛酸漿中分離提取得到的睡茄內(nèi)酯類化合物，現(xiàn)代藥理研究表明PPB 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用[7]。本課題組前期研究表明PPB 對(duì)正常人外周血單核細(xì)胞（hPBMC）及裸鼠各臟器均無(wú)明顯毒副作用[8]，并且可以誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性和外源性凋亡[9]，但其具體機(jī)制尚不清楚。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）作為一種轉(zhuǎn)錄因子，常常通過(guò)影響細(xì)胞周期[10]、細(xì)胞凋亡[11]或自噬[12]等參與各種實(shí)體惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究證實(shí)STAT3 的異常激活會(huì)導(dǎo)致下游靶基因B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）的激活，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[13]。基于文獻(xiàn)調(diào)研和課題組前期研究結(jié)果，本研究主要探討STAT3在PPB 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 PPB 由本課題組制備所得，經(jīng)高效液相（HPLC）鑒定其純度≥96%[14]，結(jié)構(gòu)式見圖1。無(wú)菌條件下，將其溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，配成濃度為50 mmol/L 原液儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩３Ｓ迷噭┖蛢x器有：RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)31800022）；胎牛血清（以色列BI 公司，貨號(hào)04-001-1ACS）；青鏈霉素混合液100×（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P1400）；噻唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)906M051）；Hoechst33342熒光分子探針（Invitrogen）；STAT3 抑制劑S3I-201（Selleck，貨號(hào)S1155）；STAT3 小干擾RNA（siRNA，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；Lipofectamine 2000（Thermo Fisher）；高內(nèi)涵成像儀（IN Cell Analyzer 2500HS）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（Tanon，型號(hào)5200）；酶標(biāo)儀（Bio Tek，型號(hào)SN 254962）；二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（Heal Force，型號(hào)HF90）。

圖1 PPB 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡情況

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液100×的RPMI-1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 熒光染色法分析細(xì)胞凋亡情況 將MCF-7 細(xì)胞接種于6 孔板，待貼壁生長(zhǎng)24 h 后，小心棄去培養(yǎng)基，每孔加入含藥培養(yǎng)基，PPB 終濃度為0、4、8、16 μmol/L。待藥物作用48 h 后，吸棄培養(yǎng)基，加入含有1 μg/mL Hoechst 33342 的完全培養(yǎng)基避光染色30 min，再次吸棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗1～2 次，立刻用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照計(jì)數(shù)，具體方法詳見參考文獻(xiàn)[15]。

1.4 MTT 檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率 將MCF-7細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96 孔板，貼壁生長(zhǎng)24 h后吸棄培養(yǎng)基，加入含不同濃度（5、10、20 μmol/L）STAT3 抑制劑S3I-201 的完全培養(yǎng)基50 μL，作用1 h后，每孔再加入50 μL 完全培養(yǎng)基或含16 μmol/L PPB 的完全培養(yǎng)基，于CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 的10% MTT 溶液作用2.5 h。再吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 的DMSO 溶解藍(lán)紫色甲臜結(jié)晶，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度（A），并按以下公式計(jì)算抑制率：抑制率（%）=（A對(duì)照品-A樣品）÷（A對(duì)照品-A空白）×100%。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法考察蛋白表達(dá)水平 將收集到的細(xì)胞溶解于RIPA 裂解液中，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，離心半徑為18 cm。離心結(jié)束后收集上清，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各樣品蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液，在金屬浴中于95 ℃反應(yīng)5 min 使蛋白變性，樣品于-20°C 條件下儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋好的一抗于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜，第2 天加入二抗在搖床上孵育1 h。最后將條帶浸于化學(xué)發(fā)光試劑中后立刻取出，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀曝光條帶。

1.6 siRNA 轉(zhuǎn)染敲降MCF-7 細(xì)胞中STAT3 基因 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7 細(xì)胞接種至96 孔板或6 孔板中，使其貼壁生長(zhǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前1～2 h 更換成雙無(wú)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。使用雙無(wú)培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 輕輕混勻，室溫放置5 min。使用雙無(wú)培養(yǎng)基稀釋STAT3 siRNA，輕輕混勻，室溫放置5 min。隨后將稀釋好的Lipofectamine 2000 與稀釋好的siRNA 等體積輕輕混勻，室溫放置20 min，以便形成siRNA/Lipofectamine 2000 復(fù)合物。棄去原有培養(yǎng)基，加入配制好的含siRNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物的雙無(wú)培養(yǎng)基，并輕輕晃動(dòng)，將培養(yǎng)板放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染8 h，吸棄上清更換為含16 μmol/L PPB 的完全培養(yǎng)基。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PPB 誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡 前期課題組運(yùn)用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)及Western Blot 法研究發(fā)現(xiàn)PPB 可以誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡[9]，本研究進(jìn)一步使用Hoechst 33342 熒光分子探針對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色標(biāo)記，分析PPB 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)完整，呈現(xiàn)均一的高強(qiáng)度藍(lán)色熒光，而PPB 處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞大小和形態(tài)不均一，且出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，即細(xì)胞核固縮呈致密濃染，染色質(zhì)邊集、凝聚，核碎片，凋亡比率呈劑量依賴性上升，這些結(jié)果進(jìn)一步證明PPB 可以誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡。見圖1。

2.2 利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PPB 抗乳腺癌的潛在機(jī)制 通過(guò)SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和pharmmaper 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）分析了PPB可能的作用靶點(diǎn)，剔除重復(fù)后得到124 個(gè)可能靶點(diǎn)。乳腺癌疾病靶點(diǎn)來(lái)源于GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的基因芯片GSE45827，該芯片包含了130 個(gè)乳腺癌樣本和11 個(gè)正常乳腺樣本，使用乳腺癌樣本對(duì)比正常樣本，共得到14 743 個(gè)差異基因。對(duì)PPB 和乳腺癌疾病靶點(diǎn)的交集進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)共有82 個(gè)共同靶點(diǎn)，見圖2A。

圖2 生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)PPB 抗乳腺癌的潛在機(jī)制

于共同靶點(diǎn)中篩選在乳腺癌中表達(dá)差異的基因，以P＜0.05 為條件篩選得到差異表達(dá)基因，Log2FC值＞2 輸出為上調(diào)基因，Log2FC 值＜-2 輸出為下調(diào)基因，見圖2B。乳腺癌組織中STAT3 上調(diào)，且STAT3高表達(dá)的患者生存期較短，見圖2C。為了確定STAT3的相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步將TCGA-KIRC 數(shù)據(jù)集與GSE42568 數(shù)據(jù)集中的乳腺癌樣本合并，根據(jù)基因表達(dá)中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用GeneSet Enrichment Analysis（GSEA）軟件進(jìn)行分析，見圖2D，單基因GSEA 揭示了乳腺癌組織中STAT3 的上調(diào)與凋亡信號(hào)通路（NES=-1.6，P=0.009）呈負(fù)相關(guān)。而前期研究結(jié)果表明PPB 能夠誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞凋亡[9]，由此推測(cè)STAT3 可能參與PPB 誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

2.3 PPB 抑制STAT3 磷酸化 基于上述生物信息學(xué)結(jié)果，本研究采用Western Blot 法考察0～16 μmol/L的PPB 作用48 h 對(duì)MCF-7 細(xì)胞中STAT3 蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果如圖3A 及圖3B所示，STAT3 及其磷酸化形式的蛋白表達(dá)水平隨PPB 劑量增加而顯著減少，說(shuō)明PPB 能夠抑制MCF-7 細(xì)胞中STAT3的磷酸化。

圖3 PPB 抑制STAT3 磷酸化情況

2.4 PPB 通過(guò)抑制STAT3 抑制MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng) 盡管上述結(jié)果證明PPB 能夠抑制STAT3 的磷酸化，但STAT3 是否參與了PPB 抑制MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)仍不明確。因此，本研究先采用STAT3 的特異性抑制劑S3I-201 預(yù)處理MCF-7 細(xì)胞1 h，再以不同劑量的PPB 作用48 h，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果如圖4A所示，S3I-201 顯著促進(jìn)了PPB 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，提示STAT3 在PPB抑制MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞存活的作用。

圖4 PPB 通過(guò)抑制STAT3 抑制MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)情況

采用siRNA 敲降MCF-7 細(xì)胞中的STAT3 基因，敲降作用效果見圖4D。再通過(guò)Western Blot 法考察PPB 處理對(duì)STAT3 的影響，結(jié)果如圖4B 及圖4C所示，與siRNA 陰性對(duì)照組（NC siRNA 組）比較，STAT3 siRNA 組STAT3 表達(dá)明顯下降。此外，與NC siRNA 組相比，PPB+NC siRNA 組顯著抑制了STAT3 磷酸化，而PPB+STAT3 siRNA 組較PPB+NC siRNA 組對(duì)p-STAT3 的抑制作用更強(qiáng)。這一結(jié)果與圖3A、圖3B 一致，說(shuō)明PPB 確實(shí)能夠抑制STAT3磷酸化。本研究又采用MTT 法考察敲降STAT3 后，PPB 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果如圖4D所示，與NC siRNA+PPB 組相比，STAT3 siRNA+PPB 組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率顯著增加，說(shuō)明敲降STAT3 促進(jìn)了PPB 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，該結(jié)果與STAT3 抑制劑S3I-201 一致，共同說(shuō)明PPB 通過(guò)抑制STAT3 抑制了MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.5 PPB 通過(guò)抑制STAT3 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡 采用Western Blot 法檢測(cè)STAT3 敲降后對(duì)MCF-7 細(xì)胞中內(nèi)源性凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、細(xì)胞色素c（Cytochromec）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Caspase9）和外源性凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8（Caspase8）及多聚ADP 核糖聚合酶（PARP）的影響。結(jié)果如圖5所示，PPB+NC siRNA顯著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，增加促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)（圖5A、圖5B）；在增加Cytochromec、裂解的Caspase8（Cleaved-Caspase8）、裂解的Caspase9（Cleaved-Caspase9）及裂解的PARP（Cleaved-PARP）表達(dá)的同時(shí)降低Caspase9、Caspase8 及PARP 的表達(dá)（圖5A、圖5C、圖5D、圖5E、圖5F），而這些現(xiàn)象在敲降STAT3 之后進(jìn)一步增強(qiáng)。以上結(jié)果表明PPB通過(guò)抑制STAT3 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖5 PPB 通過(guò)抑制STAT3 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡情況

3 討論與結(jié)論

睡茄內(nèi)酯類化合物是一種天然存在的甾體類化合物，主要存在于茄科植物睡茄屬、曼陀羅屬、假酸漿屬及酸漿屬中，現(xiàn)代藥理研究表明該類化合物對(duì)多株腫瘤細(xì)胞顯示出良好的抗腫瘤活性[16-17]。PPB正是從酸漿屬植物毛酸漿中分離提取出來(lái)的一種睡茄內(nèi)酯類化合物，前期課題組研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPB可以誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性和外源性凋亡[8]，本研究運(yùn)用熒光染色法再次證實(shí)PPB 可以誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生凋亡。隨后，本研究進(jìn)一步探究了STAT3 通路在PPB 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用。

據(jù)報(bào)道，STAT3 的過(guò)度激活已見于多種腫瘤類型，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、腎癌等[18]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的STAT3 被異常激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶和抗凋亡分子的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，使得腫瘤細(xì)胞獲得持續(xù)增殖能力[19]。因此，STAT3 是腫瘤領(lǐng)域值得探究的一個(gè)靶點(diǎn)。本研究生物信息學(xué)結(jié)果也表明STAT3 在乳腺癌中高表達(dá)，且預(yù)后不良，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPB 能夠以劑量依賴性的方式抑制STAT3磷酸化，并且與文獻(xiàn)報(bào)道的STAT3 促腫瘤作用一致[19]。STAT3 抑制劑S3I-201 及siRNA 預(yù)處理均可顯著增加PPB 對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，說(shuō)明STAT3 促進(jìn)MCF-7 細(xì)胞存活，而PPB 正是通過(guò)抑制STAT3 磷酸化抑制MCF-7 細(xì)胞生長(zhǎng)。研究還發(fā)現(xiàn)PPB 作用MCF-7 細(xì)胞后，不僅抑制磷酸化STAT3（p-STAT3）的蛋白表達(dá)，而且還抑制STAT3 的蛋白表達(dá)，這與其他藥物作用于乳腺癌細(xì)胞只降低抑制STAT3 磷酸化水平不同[20]，且與之前的研究——PPB誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細(xì)胞死亡中只影響了STAT3 的磷酸化，而對(duì)STAT3 表達(dá)無(wú)顯著影響的結(jié)果也不盡相同。因此，研究推測(cè)PPB 可能通過(guò)降低STAT3 的表達(dá)進(jìn)一步抑制STAT3 的磷酸化，而具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡抵抗是其持續(xù)增殖的主要原因之一[21]。多項(xiàng)研究顯示STAT3 的激活主要通過(guò)影響由線粒體誘導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，進(jìn)而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受凋亡[22]。具體來(lái)說(shuō)，STAT3 常常影響B(tài)cl-2 家族蛋白，該家族蛋白在凋亡途徑中的調(diào)節(jié)作用極為關(guān)鍵，是細(xì)胞凋亡的中央控制器，如研究發(fā)現(xiàn)沉默STAT3 可以導(dǎo)致人胃癌BGC-823 細(xì)胞活力顯著降低、細(xì)胞凋亡增加以及Bcl-2 表達(dá)減弱[23]。竹節(jié)香附素A 通過(guò)抑制由活性氧介導(dǎo)的STAT3 激活促進(jìn)Bax 表達(dá)，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡與增殖[24]。本研究中的生物信息學(xué)結(jié)果也提示PPB和乳腺癌疾病的共同靶點(diǎn)STAT3 與凋亡呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示STAT3 可能參與PPB 誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞凋亡。與該分析結(jié)果一致，Western Blot 結(jié)果也提示siRNA 敲降STAT3 可以進(jìn)一步促進(jìn)PPB 對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)源性凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Cytochromec、Caspase9 的作用。另外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)siRNA敲降STAT3 之后，PPB 能夠影響MCF-7 細(xì)胞中外源性凋亡蛋白Caspase8 的表達(dá)。這些結(jié)果表明PPB抑制STAT3 不僅誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性凋亡，還可以發(fā)生外源性凋亡。

本研究證實(shí)了PPB 通過(guò)抑制STAT3 通路誘導(dǎo)MCF-7 細(xì)胞發(fā)生內(nèi)源性和外源性凋亡，所獲結(jié)果豐富了PPB 抗乳腺癌的機(jī)制，為其抗乳腺癌的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)及依據(jù)。然而，乳腺癌發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素相互作用的結(jié)果，PPB 抑制乳腺癌生長(zhǎng)的詳細(xì)機(jī)制仍有待于進(jìn)一步深入研究。