羌活勝濕湯物質基準多指標成分含量測定及量值傳遞分析*

王敏，薛志峰，孫新茹，李丹丹，王志娟，惠玉玉，劉志東

（1.天津中醫藥大學，現代中藥發現與制劑技術教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫藥大學，組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.哈爾濱珍寶制藥有限公司，哈爾濱 150040）

羌活勝濕湯（QSD）出自金代醫家李東垣所著《內外傷辨惑論》[1]，由羌活、獨活、藁本、防風、川芎、炙甘草、蔓荊子7 味中藥組成，具有祛風勝濕止痛之功，主治風濕在表之痹證，是臨床祛風濕止痛的中藥復方。現代臨床研究表明本方主要用于關節炎、頸椎病、偏頭痛、肩背疼痛等疾病的治療[2]。經典名方是近年來的研究熱點，其復方制劑是中藥產品發展的重要途徑[3]，而經典名方物質基準更是其復方制劑研發和開展的核心內容，QSD 被收錄在國家中醫藥管理局發布的第1 批古代經典名方目錄中。目前，關于QSD 的文獻報道多集中于藥理作用及臨床應用領域，物質基準方面鮮有研究。本研究根據國家藥品監督管理局發布的《古代經典名方關鍵信息考證原則》等相關指導原則，通過制備15 批經典名方QSD 物質基準凍干粉，采用高效液相（HPLC）法建立QSD 多指標成分含量測定方法，測定其指標成分含量，進行飲片到物質基準之間的量值傳遞分析，為經典名方QSD 后續的研究及相關制劑研發的質量控制提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260 型高效液相色譜儀，DAD 檢測器，美國Agilent 公司；AX205 型十萬分之一天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；FA124 型萬分之一天平，天津億諾科學儀器有限公司；Milli-Q 超純水系統，美國Millipore 公司；DZL 煎藥壺，潮州市潮安區康爾順貿易有限公司；TDGC2-3KVA 型接觸式調壓器，飄風電器有限公司；N-10000 旋轉蒸發儀，日本EYELA 公司；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴槽，天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-400B 超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；FW100 型萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；B-290 型噴霧干燥儀，瑞士Buchi 公司；DZF-6090 型真空干燥箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；FDU-2100 型冷凍干燥機，日本EYELA 公司。

1.2 試藥 羌活醇（111820-201504，含量以99.9%計）、二氫歐山芹醇當歸酸酯（111583-201605，含量以98.6%計）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（111523-201610，含量以96.1%計）、蔓荊子黃素（111554-201705，含量以98.3%計）、異歐前胡素對照品（110827-201611，含量以99.4%計）、甘草酸銨對照品（110731-201619，含量以93.0%計）均購自中國食品藥品鑒定研究所；甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司），乙腈（色譜級，賽默飛世爾科技有限公司），磷酸（色譜級，批號130271，賽默飛世爾科技有限公司），實驗室自制超純水；QSD 物質基準15 批次，批號及所用飲片產地信息見表1，由黑龍江珍寶島藥業股份有限公司提供，經過天津中醫藥大學祁東利副研究員鑒定羌活NOTOPTERYGⅡRHIZOMA ET RADIX、獨活ANGELICAE PUBESCENTIS RADIX、藁本LIGUSTICI RHIZOMA ET RADIX、防風SAPOSHNIKOVIAE RADIX、炙甘草GLYCYRRHIZAE RADIX ET RHIZOMA PRAEPARATA CUM MELLE、川芎CHUANXIONG RHIZOMA、蔓荊子VITICIS FRUCTUS 均符合《中華人民共和國藥典》2020年版要求。

表1 15 批QSD 物質基準組合信息表

2 方法與結果

2.1 指標成分含量測定 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱。流動相為乙腈-0.05%磷酸水。洗脫梯度：0～15 min，12%～15%乙腈；15～37 min，15%～19%乙腈；37～52 min，19%～24%乙腈；52～64 min，24%～27%乙腈；64～75 min，27%～37%乙腈；75～92 min，37%～50%乙腈；92～109 min，50%～58%乙腈；109～113 min，58%～90%乙腈；113～125 min，90%乙腈。柱溫30 ℃。體積流量0.8 mL/min。進樣量10 μL。檢測波長：254（檢測5-O-甲基維斯阿米醇苷和蔓荊子黃素）、310（檢測羌活醇和異歐前胡素）、237（檢測甘草酸銨）、330（檢測二氫歐山芹醇當歸酸酯）nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當歸酸酯對照品適量，加入甲醇制成1 mL 含18.08 μg 5-O-甲基維斯阿米醇苷、4.47 μg 蔓荊子黃素、44.7 μg 羌活醇、8.016 μg 異歐前胡素、504 μg 甘草酸銨、4.29 μg 二氫歐山芹醇當歸酸酯的混合對照品溶液。

2.3 QSD 物質基準凍干粉的制備 采用隨機數字表法，分別對方中各飲片進行隨機組合，見表1。《內外傷辨惑論》原文記載的QSD 處方及制法為“羌活、獨活各一錢，藁本、防風、甘草（炙）、川芎各五分，蔓荊子三分。上咀，都作一服，水二盞，煎至一盞，去渣，大溫服，空心食前”。經前期考證，確定處方劑量為羌活、獨活各3.0 g，川芎、藁本、炙甘草、防風各1.5 g，蔓荊子0.9 g。取各飲片置于砂鍋中，加入去離子水400 mL，浸泡30 min 后煎煮至藥液體積剩余約200 mL，使用兩層紗布趁熱過濾，置于室溫冷卻后，將標準湯劑旋轉蒸發至流浸膏，預凍后冷凍干燥，即得15 批QSD 物質基準凍干粉，同法制備各陰性凍干粉。

2.4 供試品溶液的制備 取“2.3”項下制備的QSD凍干粉0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密移取60%甲醇（v/v）10 mL，稱取質量，320 W、40 kHz 超聲處理45 min，放冷至室溫，補足失去質量，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.5 含量測定方法學考察

2.5.1 專屬性考察 分別精密吸取按“2.2”項及“2.4”項下制備得到的各對照品溶液、供試品溶液及各陰性樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果顯示，陰性對照圖中顯示對5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當歸酸酯的測定無干擾。

圖1 QSD 專屬性考察HPLC 圖

2.5.2 線性關系考察 精密吸取按“2.2”項下制備的混合對照品溶液適量，用甲醇稀釋成不同質量濃度的系列對照品溶液。按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸，繪制標準曲線，如表2所示。結果表明，各指標成分線性關系良好。

表2 QSD 物質基準中指標性成分含量測定方法學考察

2.5.3 精密度實驗 精密吸取一定濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下的含量測定色譜條件進樣洗脫，連續進樣6 次，記錄各指標成分峰面積，計算得到的峰面積RSD值均小于3.00%，結果表明該方法儀器精密度良好。

2.5.4 穩定性實驗 取同一批物質基準供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24、36、48 h 進樣分析，記錄峰面積，計算5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當歸酸酯峰面積的RSD值分別為2.85%、1.91%、0.92%、2.53%、0.67%、2.01%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.5.5 重復性實驗 取同一批物質基準供試品溶液6 份，按“2.1”項下的色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算5-O-甲基維斯阿米醇苷、蔓荊子黃素、羌活醇、異歐前胡素、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當歸酸酯含量的RSD值分別為2.86%、1.60%、0.76%、0.71%、0.81%、0.89%，表明該方法重復性良好。

2.5.6 加樣回收率實驗 取上述重復性實驗已測定各指標成分含量的同批次QSD 物質基準凍干粉適量，精密稱定，分別以指標成分含量的50%加入各指標成分對照品儲備液各6 份，按“2.4”項下的方法制備供試品溶液。按“2.1”項下的色譜條件進樣測定，計算各指標成分的回收率。結果如表1所示，各指標成分平均加樣回收率均在95%～105%，RSD在0.77%～3.69%，結果表明加樣回收率良好。

2.6 15 批QSD 物質基準指標成分含量及飲片-物質基準轉移率測定 采用“2.4”項下的方法分別制備15 批物質基準供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣測定15 批物質基準中各指標成分的含量，各飲片按照《中華人民共和國藥典》2020年版進行含量測定[4]，按公式“轉移率（%）=[物質基準中指標成分含量（mg/g）]÷[對應批次飲片中指標成分含量（mg/g）]×100%”計算各指標成分飲片到物質基準的含量轉移率，結果見表3 及表4。

表4 飲片-物質基準中甘草酸銨、蔓荊子黃素、二氫歐山芹醇當歸酸酯轉移率%

由表3、表4 結果可知，15 批物質基準中指標成分5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為1.27～2.81 mg/g，平均轉移率為77.60%，轉移率均值的±30%為54.32%～100.88%；羌活醇含量為1.09～1.70 mg/g，平均轉移率為16.82%，轉移率均值的±30%為11.77%～21.87%；異歐前胡素含量為0.03～0.28 mg/g，平均轉移率為1.44%，轉移率均值的±30%為1.01%～1.87%；甘草酸銨含量為12.74～33.78 mg/g，平均轉移率為54.86%，轉移率均值的±30%為38.40%～71.32%；蔓荊子黃素含量為0.09～0.59 mg/g，平均轉移率為9.30%，轉移率均值的±30%為6.51%～12.09%；二氫歐山芹醇當歸酸酯含量為0.06～0.20 mg/g，平均轉移率為8.93%，轉移率均值的±30%為6.25%～11.60%。

3 討論

3.1 含量測定及指標成分的選擇 中藥有效成分作為中藥的藥效物質基礎，其選擇及確定是中藥復方及單味藥材質量控制的重要過程，含量測定指標成分的選擇不僅要符合《中華人民共和國藥典》2020年版[4]的規定，還要確保其在相應的飲片、物質基準及復方能夠實現可靠穩定的質量控制。本方選取的指標成分羌活醇、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草酸銨、蔓荊子黃素、5-O-甲基維斯阿米醇苷均為《中華人民共和國藥典》2020年版[4]中羌活、獨活、甘草、蔓荊子、防風藥材的含量測定成分，均為專屬性成分，且對于他們的藥理作用有明確的文獻報道[5-16]。獨活、甘草在《中華人民共和國藥典》2020年版中含量測定的成分還有蛇床子素、甘草苷，進行專屬性實驗時在獨活陰性中有干擾；甘草苷出現峰形不好、不易分開等現象，故蛇床子素與甘草苷沒有作為指標成分進行測定。《中華人民共和國藥典》2020年版中藁本、川芎的含量測定成分均為阿魏酸，無法作為專屬性指標成分，且藁本、川芎的化學成分相似[17-18]，經實驗研究，未在藁本、川芎中找到專屬性成分。

3.2 色譜條件及樣品處理方法的考察 本實驗前期對含量測定色譜條件的不同流速（0.7、0.8、0.9mL/min）、不同柱溫（30、35、40 ℃）、不同比例的流動相進行梯度洗脫，考察色譜圖出峰個數、峰形及分離度情況。結果表明流速為0.8 mL/min、柱溫為30 ℃時，各峰形較好，分離度較好，整體基線較平穩。對樣品的處理方法考察了不同比例甲醇、乙腈和純水的提取溶劑，不同超聲功率及超聲時間，以色譜圖整體峰形及分離度結果確定了60%甲醇復溶、超聲功率320W、超聲45 min 的樣品處理方法。

3.3 物質基準各指標成分的含量及量值傳遞分析 根據《古代經典名方中藥復方制劑的申報資料要求（征求意見稿）》中的指導建議，出膏率、指標性成分含量轉移率應在均值±30%的波動范圍內。結果提示15 批物質基準的平均出膏率為31.86%，RSD為3.77%，均未出現離散數據（平均值的70%～130%以外）。指標成分5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨、二氫歐山芹醇當歸酸酯轉移率均在均值±30%內；異歐前胡素轉移率中S5、S15 批次超出范圍；蔓荊子黃素轉移率中S2、S5、S9、S14 批次超出范圍；羌活醇轉移率中S1、S4、S9、S13、S14、S15 批次超出范圍。分析其原因發現不同批次飲片中羌活醇、異歐前胡素、蔓荊子黃素含量差異較大，導致多批次飲片-物質基準轉移率超出范圍；中藥成分復雜，中藥復方中各成分相互作用、相互影響也是造成指標成分轉移率波動范圍較大的原因之一；15 批QSD 物質基準各指標成分含量范圍較大，組成QSD 物質基準的飲片含量差異較大，15 批QSD 物質基準的原料來自不同產地，導致其各項指標成分含量差異較大。所以在以后的研究中，要確保選取藥材的來源和質量穩定，進行藥材道地產地和主產地之間指標含量等質量的差異分析，選擇一定的含量范圍，以此初步選定藥材產地，除此之外投料的均一性也是保證含量穩定的重要條件[19]。建議剔除離散程度較大的批次數值，后續研究增加物質基準研究批次，嚴格控制飲片的質量波動，以保證不同批次物質基準的質量相對穩定，降低離散值的影響，以期建立更加具有代表性的物質基準相關質量標準。

4 結論

本實驗通過制備15 批QSD 物質基準凍干粉，建立其含量測定方法，測定專屬成分羌活醇、異歐前胡素、二氫歐山芹醇當歸酸酯、甘草酸銨、蔓荊子黃素、5-O-甲基維斯阿米醇苷含量并進行飲片到物質基準量值傳遞分析，建議在后續的研究中嚴格把控投料飲片的質量情況，以期為經典名方QSD 后續物質基準與制劑研發的一致性和穩定性提供依據。