利多卡因調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白軸對胃癌細(xì)胞化療敏感性的影響

史國強(qiáng), 谷甫艷, 牛衛(wèi)康, 李喜龍

(新鄭華信民生醫(yī)院 麻醉科, 河南 鄭州, 450000)

胃癌是臨床常見的消化道腫瘤,發(fā)病率和致死率均較高,嚴(yán)重威脅公眾健康[1]。利多卡因是臨床常用的酰胺衍生物局部麻醉劑和抗心律失常藥,具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗癌藥增敏等作用[2]。研究[3]表明,利多卡因可在胃癌進(jìn)展過程中發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。謝玉海等[4]研究顯示,利多卡因能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。研究[5]表明,利多卡因可通過微小RNA(miR)-195抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并增強(qiáng)其對順鉑化療的敏感性。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)途徑包括一系列蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。Wnt/β-catenin信號失調(diào)常會引發(fā)各種嚴(yán)重疾病,包括癌癥和非癌癥疾病[6]。研究[7]表明,Serpin家族H成員1(SERPINH1)通過Wnt/β-catenin途徑調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和胃癌的進(jìn)展。研究[8]顯示,抑制Wnt/β-catenin通路激活可增強(qiáng)肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞對吉西他濱的化療敏感性。目前,利多卡因在胃癌中的作用機(jī)制尚未明確,本研究基于Wnt/β-catenin信號通路探討利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞化療敏感性的影響及其可能機(jī)制,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胃癌細(xì)胞SGC-7901(CL-0206), 購自武漢普諾賽生命科技有限公司; 利多卡因(BP727), 購自Sigma-Aldrich公司; SKL2001(S8320), 購自Selleck公司; 順鉑(D807330), 購自上海麥克林生化科技股份有限公司; 噻唑藍(lán)(MTT)細(xì)胞活力檢測試劑盒(E-CK-A341)、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒(E-CK-A375), 購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司; TUNEL試劑盒(P-CA-303), 購自武漢普諾賽生命科技有限公司; 抗體B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白(Bax, 貨號ab32503)、B細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)蛋白-2(Bcl-2, 貨號ab182858)、裂解半胱天冬酶-3(Cleaved-Caspase-3, 貨號ab32042)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,貨號ab231303)、波形蛋白Vimentin(貨號ab20346)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin, 貨號ab76011)、周期蛋白D1(Cyclin Dl, 貨號ab16663)、β-catenin(貨號ab32572)、Wnt家族成員3a(Wnt3a, 貨號ab219412)、散亂蛋白2(DVL2, 貨號ab277903)、β-actin(貨號ab8226)、與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的IgG(貨號ab6728)均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞活力檢測: 將人胃癌細(xì)胞SGC-7901在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并置于培養(yǎng)箱(37 ℃, 5%CO2)中,待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。將對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板中(1×104個(gè)/孔),用不同濃度利多卡因(0、10、50、100、150、200 μmol/L)處理24 h。加入MTT溶液20 μL, 37 ℃孵育4 h。然后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO), 孵育15 min(37 ℃), 使用酶標(biāo)儀于490 nm處讀取光密度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞活力,細(xì)胞活力=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD對照組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理: 將對數(shù)生長期細(xì)胞分為對照組(Control組)、順鉑組(Cisplatin組)、利多卡因低濃度組(Lido-L組)、利多卡因中濃度組(Lido-M組)、利多卡因高濃度組(Lido-H組)、利多卡因高濃度+Wnt/β-catenin信號通路激活劑SKL2001組(Lido-H+SKL2001組)。Cisplatin組使用30 μg/mL順鉑處理SGC-7901細(xì)胞24 h, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組分別使用50、100、150 μmol/L利多卡因與30 μg/mL順鉑共同處理細(xì)胞24 h, Lido-H+SKL2001組使用150 μmol/L利多卡因、30 μg/mL順鉑和1 μmol/L SKL2001[9]處理細(xì)胞24 h, Control組給予等量生理鹽水。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測: 取各組SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng), 5×103個(gè)/孔。將細(xì)胞與10 μmol/L EdU于37 ℃培養(yǎng)2 h, 并在4%甲醛中固定,用Apollo反應(yīng)混合物和DAPI染色液(鑒定細(xì)胞核)染色30 min, 在熒光顯微鏡下對增殖陽性細(xì)胞進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。EdU陽性率(%)=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)(DAPI染色陽性)×100%。

1.2.4 細(xì)胞侵襲和遷移檢測: 采用Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力,上層用無血清培養(yǎng)基填充細(xì)胞,下層補(bǔ)充血清培養(yǎng)基, 37 ℃孵育,甲醇固定,然后用0.5%結(jié)晶紫對細(xì)胞染色10 min, 最后使用光學(xué)顯微鏡拍攝圖像,隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)算每個(gè)視野侵襲細(xì)胞數(shù)量。采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力,當(dāng)各組細(xì)胞融合度達(dá)到約90%時(shí),用移液管吸頭刮擦細(xì)胞單層以形成均勻劃痕,并用無血清磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗掉劃下的細(xì)胞,培養(yǎng)24 h。光學(xué)顯微鏡下拍照觀察,記錄0 h和24 h劃痕融合情況,并計(jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。劃痕愈合率=(W0 h-W24 h)/W0 h×100%,W為劃痕寬度。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測: 將各組SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)過夜,使用TUNEL試劑盒按照說明書要求檢測細(xì)胞凋亡情況。隨機(jī)選取5個(gè)視野,熒光顯微鏡下拍照觀察,計(jì)算細(xì)胞凋亡率(%)=TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)(DAPI染色陽性)×100%。

1.2.6 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測: 使用RIPA緩沖液裂解各組SGC-7901細(xì)胞,提取總蛋白裂解物,通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的總蛋白裂解物。將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,使用含0.5% Tween-20和5%脫脂奶粉的PBS封閉1 h,然后添加一抗Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Cyclin Dl、β-catenin、Wnt3a、DVL2和β-actin于PVDF膜孵育過夜(4 ℃),再與相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,ECL顯影。應(yīng)用Image J軟件檢測蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞活力的影響

與0 μmol/L利多卡因相比, 10 μmol/L利多卡因處理的SGC-7901細(xì)胞活力降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05); 與0 μmol/L利多卡因相比,50、100、150、200 μmol/L利多卡因處理的SGC-7901細(xì)胞活力均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表1。因?yàn)?0 μmol/L利多卡因?qū)?xì)胞活力的影響較小, 200 μmol/L利多卡因處理的細(xì)胞活力較低,所以本研究選用50、100、150 μmol/L利多卡因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),見表1。

表1 不同濃度利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞活力的影響 %

2.2 利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞增殖的影響

與Control組相比, Cisplatin組SGC-7901細(xì)胞EdU陽性率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Cisplatin組相比, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組SGC-7901細(xì)胞EdU陽性率呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Lido-H組相比, Lido-H+SKL2001組SGC-7901細(xì)胞EdU陽性率升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖1、表2。

表2 各組SGC-7901細(xì)胞EdU陽性率比較 %

2.3 利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞侵襲和遷移的影響

與Control組相比, Cisplatin組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)和劃痕愈合率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Cisplatin組相比, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)和劃痕愈合率呈濃度依賴性降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Lido-H組相比, Lido-H+SKL2001組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)和劃痕愈合率增長,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2、圖3和表3。

表3 各組SGC-7901細(xì)胞侵襲數(shù)和細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.4 利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的影響

與Control組相比, Cisplatin組SGC-7901細(xì)胞凋亡率升高, Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)增加, Bcl-2蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Cisplatin組相比, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組SGC-7901細(xì)胞凋亡率升高, Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)增加, Bcl-2蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且呈濃度依賴性; 與Lido-H組相比, Lido-H+SKL2001組SGC-7901細(xì)胞凋亡率和Bax、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)降低, Bcl-2蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖4、圖5和表4。

表4 各組SGC-7901細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.5 利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞EMT的影響

與Control組相比, Cisplatin組SGC-7901細(xì)胞Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)降低, E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Cisplatin組相比, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組SGC-7901細(xì)胞Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)降低, E-cadherin蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 且呈濃度依賴性; 與Lido-H組比較, Lido-H+SKL2001組SGC-7901細(xì)胞Vimentin、N-cadherin蛋白表達(dá)增加, E-cadherin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖6、表5。

表5 各組SGC-7901細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.6 利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與Control組相比, Cisplatin組SGC-7901細(xì)胞Cyclin Dl、DVL2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Cisplatin組相比, Lido-L組、Lido-M組、Lido-H組SGC-7901細(xì)胞Cyclin Dl、DVL2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)依次降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 與Lido-H組比較, Lido-H+SKL2001組SGC-7901細(xì)胞Cyclin Dl、DVL2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見圖7、表6。

表6 各組SGC-7901細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

3 討 論

手術(shù)是胃癌首選治療方式,但由于早期診斷率低,患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率很高[10]。利多卡因是臨床常用的局部麻醉劑之一,具有許多藥理作用,可直接或間接影響多種癌癥[11]。ZENG W等[12]研究表明,利多卡因治療可使胃癌細(xì)胞的惡性行為受到顯著抑制,細(xì)胞活力、遷移能力和侵襲能力下降,還可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究中,利多卡因處理SGC-7901細(xì)胞后細(xì)胞活力降低,表明利多卡因能抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

順鉑是一種化療藥物,能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,然而化療耐藥性亦不容忽視,因此,增強(qiáng)癌細(xì)胞化療敏感性在胃癌治療中相當(dāng)重要[13]。Bax和Cleaved-Caspase-3是凋亡相關(guān)蛋白,上調(diào)其水平能促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[14]。細(xì)胞周期相關(guān)分子參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展[15], Cyclin D1與細(xì)胞增殖密切相關(guān),在胃癌組織中高表達(dá)。ZHANG Y等[16]研究表明,下調(diào)Bcl-2及Cyclin D1等相關(guān)細(xì)胞周期蛋白水平可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。ZHANG X M等[17]研究表明,順鉑能顯著提高細(xì)胞凋亡率和Bax、裂解的胱天蛋白酶-3和裂解的PARP蛋白表達(dá)水平。利多卡因可進(jìn)一步增加順鉑驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡數(shù)量及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,在一定程度上削弱耐藥細(xì)胞的順鉑耐藥性。本研究中,順鉑抑制SGC-7901細(xì)胞活力、侵襲能力及遷移能力,顯著上調(diào)Bax和Cleaved-caspase-3蛋白水平,下調(diào)Bcl-2和Cyclin D1蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而利多卡因干預(yù)可進(jìn)一步降低SGC-7901細(xì)胞活力、侵襲能力和遷移能力,上調(diào)凋亡蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,表明利多卡因能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對順鉑的化療敏感性。

β-catenin是Wnt信號通路中至關(guān)重要的信號換能器,典型Wnt信號通路基因突變常發(fā)生在癌癥中,可導(dǎo)致關(guān)鍵效應(yīng)蛋白β-catenin的異常積累[18]。Wnt/β-catenin信號通路的失調(diào)與胃癌發(fā)展和化療耐藥性密切相關(guān)[19]。失活家族蛋白是關(guān)鍵的支架蛋白,作用于Wnt/β-catenin信號通路,與各種腫瘤進(jìn)展有關(guān)。DVL2在胃癌中高表達(dá),在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用[20]。HE R F等[21]研究表明, Wnt/β-catenin信號通路的異常激活主要通過DVL2的異常表達(dá)實(shí)現(xiàn),其通過下調(diào)DVL2抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。β-catenin和Cyclin D1被證明不僅與癌癥的分化相關(guān),而且與EMT相關(guān),此外Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)胃癌中的EMT方面有關(guān)鍵作用[22]。LIAO W H等[23]研究表明,下調(diào)Wnt/β-catenin信號通路能抑制EMT過程,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞MC增殖的惡性行為并誘導(dǎo)其G0/G1期停滯,阻止胃癌的發(fā)生和發(fā)展。利多卡因和Wnt/β-catenin途徑與胃癌的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥性有關(guān)。研究[24]顯示,利多卡因?qū)nt/β-catenin信號通路具有調(diào)控作用。本研究中,利多卡因顯著下調(diào)Vimentin、N-cadherin、DVL2、Wnt3a和β-catenin蛋白表達(dá),上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá), SKL2001干預(yù)后可逆轉(zhuǎn)利多卡因?qū)GC-7901細(xì)胞的抗癌作用,降低SGC-7901細(xì)胞化療敏感性。由此表明,利多卡因能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活阻礙SGC-7901細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移并促進(jìn)其凋亡,調(diào)節(jié)細(xì)胞EMT過程,增強(qiáng)順鉑對SGC-7901細(xì)胞的化療敏感性。

綜上所述,利多卡因可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞對順鉑的化療敏感性,調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞EMT過程,抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)有關(guān)。但本研究內(nèi)容有限,其作用機(jī)制仍需結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)一步研究。