腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子/血管內(nèi)皮生長因子165對大鼠超比例隨意皮瓣成活的影響及機(jī)制研究

趙毅 閆洪偉 王玉琦 陳麗娟 洪城 田詩政

[摘要]目的：觀察術(shù)前注射腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子/血管內(nèi)皮生長因子165（Ad-HGF/VEGF165）對大鼠超比例隨意皮瓣成活的影響和其機(jī)制的初步研究。方法：大鼠背部設(shè)計(jì)超比例隨意皮瓣模型，將其隨機(jī)分為Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組和對照組。術(shù)前7 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組分別于大鼠皮瓣及創(chuàng)緣內(nèi)多點(diǎn)注射Ad-HGF/VEGF165及Ad-VEGF165，對照組注射等容量0.9%氯化鈉注射液。分別于術(shù)后7 d、14 d觀測皮瓣成活面積，切取皮瓣組織標(biāo)本HE染色、免疫組化觀察微血管密度及組織間VEGF陽性率等指標(biāo)，Western Blot檢測目的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：術(shù)后7 d、14 d，Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組皮瓣存活面積、組織間微血管數(shù)目、VEGF及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）蛋白表達(dá)情況均高于對照組（P＜0.001），且Ad-HGF/VEGF165組明顯高于Ad-VEGF165組（P＜0.05）。結(jié)論：Ad-HGF/VEGF165具有協(xié)同作用，能顯著促進(jìn)VEGF和ERK1/2信號(hào)因子表達(dá)，短期內(nèi)促進(jìn)血管網(wǎng)重建，改善皮瓣血液灌注，提高大鼠超比例隨意皮瓣成活面積。

[關(guān)鍵詞]超比例隨意皮瓣；基因治療；腺病毒；血管新生；肝細(xì)胞生長因子；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號(hào)]R622? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2024）02-0060-05

Experimental Study on the Influence of Adenovirus-mediated Hepatocyte Growth Factor/vascular Endothelial Growth Factor 165 on the Survival and Mechanism of Hyper-proportion Random Flap in Rats

ZHAO Yi1，2，YAN Hongwei2，WANG Yuqi1，CHEN Lijuan2，HONG Cheng2，TIAN Shizheng2

（1.Jinzhou Medical University，Jinzhou 121000，Liaoning，China; 2.Department of Burn Plastic Surgery，Shiyan People's Hospital/ Affiliated People's Hospital of Hubei University of Medicine，Shiyan 442000，Hubei，China）

Abstract： Objective? To observe the effect of adenovirus-mediated hepatocyte growth factor / vascular endothelial growth factor 165 （Ad-HGF/VEGF165） injection before flap operation on the survival and Mechanism of Hyper-proportion random flap in rats. Methods? The model of Hyper-proportion random flap was designed on the back of rats and randomly divided into Ad-HGF/VEGF165 group， Ad-HGF/VEGF165 group and control group. Seven days before operation， Ad-HGF/VEGF165 group and Ad-HGF/VEGF165 group were separate multipoint injection Ad-HGF/VEGF165 and Ad-VEGF165 into the rat skin flap at multiple points in the experimental group， while 0.9% sodium chloride injection was injected in the control group. The survival area of the flap was observed on the 7 day and 14 day after operation， and the tissue samples of the flap were obtained for HE staining， the microvessel density and VEGF expression were observed by immunohistochemistry， and Western blot for detection of protein of target protein. Results? On the 7 day and 14 day after operation， skin flap survival area，the number of microvessels， VEGF and the expression of extracellular regulated protein kinase （ERK1/2） protein in the Ad-HGF/VEGF165 group and Ad-HGF/VEGF165 group were higher than those in the control group（P＜0.001）， and all indexes were significantly higher in the Ad-HGF/VEGF165 group than in the Ad-VEGF165 group （P＜0.05）. Conclusion? Ad-HGF/VEGF165 has a synergistic effect， which can significantly promote the expression of VEGF and ERK1/2 signal factors， increase the survival area of Hyper-proportion random flap， promote angiogenesis and improve the blood circulation of the flap.

Key words： hyper-proportion random flap; gene-therapy; adenovirus; revascularization; hepatocyte growth factor; vascular endothelial growth factor

頭頸部腫瘤、急性外傷、重度燒傷及糖尿病等基礎(chǔ)疾病導(dǎo)致的皮膚創(chuàng)面缺損是臨床皮瓣修復(fù)手術(shù)中常見的疾病。隨意皮瓣移植因不受蒂部限制，設(shè)計(jì)和操作簡便、可重復(fù)性好，在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用[1]，但是，由于皮瓣遠(yuǎn)端延遲或不完全的血管網(wǎng)重建，限制了隨意皮瓣術(shù)后的存活率。為了拓寬皮瓣的應(yīng)用范圍，提高隨意皮瓣的存活面積，研究者通過不同的載體系統(tǒng)將多種類的外源性基因注射至受區(qū)，通過直接或旁分泌途徑提高生長因子濃度，從而誘導(dǎo)微血管形成[2-4]。但已有數(shù)據(jù)表明，僅靠一種生長因子并不能在皮瓣移植術(shù)后早期提供足夠的血運(yùn)灌注和穩(wěn)定的血管網(wǎng)絡(luò)。將多種基因聯(lián)合應(yīng)用后，發(fā)現(xiàn)可在同時(shí)期內(nèi)建立更密集的小動(dòng)脈分支[5-7]。此外，還應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)淖⑸鋾r(shí)機(jī)，否則在外源性基因高表達(dá)前，皮瓣可能因血液供應(yīng)不足而出現(xiàn)缺血性壞死。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，與術(shù)后即刻注射相比，術(shù)前注射腺病毒介導(dǎo)的外源性基因在改善皮瓣存活率和血液循環(huán)方面效果顯著[8-9]。為了優(yōu)化生長因子潛在的療效，并確保在有限的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮其生物活性，本研究結(jié)合以往理論基礎(chǔ)，采用大鼠背部超比例隨意皮瓣模型，以腺病毒為載體，術(shù)前7 d于皮瓣遠(yuǎn)端及創(chuàng)緣處局部注射Ad-HGF/VEGF165，觀察其對皮瓣成活的影響，同時(shí)測定與分析組織內(nèi)微血管數(shù)目、生長因子的變化情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器與試劑：Ad-HGF/VEGF165、Ad-VEGF165為湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床研究所王家寧博士惠贈(zèng)，VEGF兔多克隆抗體（Immunoway）、CD31羊多克隆抗體（R&D）、ERK1/2兔單克隆抗體（Cell signaling Technology）。普通/熒光顯微鏡（Nikon公司）、凝膠成像儀（BIO-RAD）、電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD）、石蠟切片機(jī)（Lecia德國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組：選用12周齡SD雄性大鼠30只（湖南斯萊克景達(dá)公司），體重250～320 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為Ad-HGF/VEGF165組、Ad-VEGF165組和對照組，每組10只。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過。

1.3 皮瓣模型制備及Ad-HGF/VEGF165運(yùn)用：以大鼠背部中線為皮瓣縱軸，肩胛下緣為皮瓣蒂部，設(shè)計(jì)8 cm×2 cm超比例隨意皮瓣。術(shù)前7 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組分別在皮瓣的中遠(yuǎn)端和邊緣處注射共計(jì)1 ml含有2×108滴度單位的Ad-HGF/VEGF165和Ad-VEGF165，每點(diǎn)注入0.05 ml，等距注射至深筋膜層，共20個(gè)點(diǎn)。對照組注入等容量的0.9%氯化鈉注射液。異氟烷氣體麻醉大鼠，俯臥位固定于操作臺(tái)，切開皮瓣皮膚，于深筋膜淺層將皮瓣自遠(yuǎn)端向蒂部掀起，皮瓣掀起后，確保破壞創(chuàng)面床與創(chuàng)緣吻合的血管網(wǎng)，將皮瓣原位縫合。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 皮瓣大體觀察及存活率：術(shù)后定期監(jiān)測大鼠皮瓣血運(yùn)情況，測量皮瓣存活區(qū)域面積，計(jì)算各組皮瓣的成活面積，并求取其皮瓣平均存活率。? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?。

1.4.2 病理學(xué)觀察：三組大鼠分別于術(shù)后7 d切取距存活與壞死組織交界處0.5 cm的近端皮瓣組織標(biāo)本，10%多聚甲醛固定后包埋切片，二甲苯脫蠟處理，光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.4.3 免疫組化：采用SABC法，抗原修復(fù)后滴加山羊血清封閉50 min，滴加一抗，VEGF、CD31抗體濃度比分別為1∶200與1∶100。放于4℃冰箱孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）充分沖洗；二抗孵育1 h，蘇木素染色。檢測不同時(shí)期CD31標(biāo)記皮瓣遠(yuǎn)端存活區(qū)的微血管生成數(shù)目，400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)求取5個(gè)不同視場的血管橫截面數(shù)目，求得各組皮瓣的新生血管數(shù)目，觀測VEGF在組織中陽性表達(dá)。

1.4.4 Western Blot：將皮瓣組織放入液氮進(jìn)行研磨，勻漿放入EP管，離心后取上清液計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，進(jìn)行SDS電泳，將制備膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入5%脫脂牛奶置于搖床封閉30 min，隨后將一抗VEGF165、ERK1/2和P-ERK1/2放于4℃冰箱孵育過夜，濃度比1∶1 000。TBS-T中沖洗3遍，室溫下二抗孵育2 h。TBS-T中沖洗3遍，每遍15 min。最后在凝膠成像儀上對蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 26.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均采用（xˉ±s）表示，三組間比較行單因素方差分析，通過t檢驗(yàn)確定兩組間差異，采用Image-Pro-Plus6.0檢測VEGF的IOD值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 皮瓣大體觀察：術(shù)后12 h，皮瓣遠(yuǎn)端區(qū)域皮溫稍涼，呈淡紫色。術(shù)后7 d，飲食及二便正常，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣遠(yuǎn)端缺血區(qū)域皮膚皺縮，繼而發(fā)黑干性壞死，部分創(chuàng)面破潰。對照組皮瓣壞死區(qū)域有少量膿性分泌物，與Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組相比壞死面積增大，存活與壞死區(qū)域界限清楚。術(shù)后14 d，對照組清除硬痂及壞死組織后基底欠新鮮，Ad-HGF/VEGF165組皮瓣末端發(fā)生血運(yùn)障礙區(qū)域較另兩組明顯減少，壞死區(qū)痂皮溶脫，顯露基底新鮮肉芽組織。見圖1。

2.2 三組大鼠皮瓣成活率比較：術(shù)后7、14 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組大鼠背部皮瓣存活面積均高于對照組，且Ad-HGF/VEGF165組高于Ad-VEGF165組（P＜0.05）。采用LSD法兩兩比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且三組數(shù)據(jù)行單因素方差分析得出P＜0.001。見表1。

2.3 組織學(xué)檢測：光鏡下觀察，術(shù)后7 d對照組皮瓣壞死區(qū)域急性炎癥反應(yīng)加重，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣成活區(qū)表現(xiàn)出較厚的真皮層，可見大量成纖維細(xì)胞增生，周圍新生血管豐富，血管壁薄。對照組表皮層較薄，血管生成少見。見圖2。

2.4 三組VEGF陽性表達(dá)情況及微血管密度比較：術(shù)后7 d，Ad-HGF/VEGF165組血管周圍呈棕黃色染色呈團(tuán)簇分布，表明有大量VEGF的表達(dá)，Ad-VEGF165組中陽性表達(dá)有所欠缺，對照組皮瓣成活區(qū)周圍組織少見。術(shù)后7 d、術(shù)后14 d，Ad-HGF/VEGF165組和Ad-VEGF165組皮瓣微血管密度均高于對照組，Ad-HGF/VEGF165組新生微血管管腔結(jié)構(gòu)良好，管壁薄。與Ad-VEGF165組相比，同時(shí)期內(nèi)建立的小血管分支更密集（P＜0.01）。見圖3～4。

2.5 Western Blot：Western Blot檢測三組各時(shí)期VEGF蛋白電泳測定結(jié)果，術(shù)后7 d達(dá)到峰值，Ad-HGF/VEGF165組的VEGF表達(dá)明顯高于另兩組，術(shù)后14 d蛋白表達(dá)有所回落。術(shù)后7 d時(shí)，Ad-HGF/VEGF165組顯現(xiàn)出對VEGF和P-ERK1/2蛋白更高的活化潛能。見圖5～6。

3? 討論

在整形與重建外科手術(shù)中，皮瓣移植術(shù)后早期促進(jìn)新生血管網(wǎng)的形成與穩(wěn)定性是提高皮瓣存活的重要因素[10-11]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，高壓氧治療、血管擴(kuò)張劑、磷酸二酯酶抑制劑等均可提高皮瓣移植后組織的氧含量并減輕炎癥反應(yīng)，使皮瓣的存活率一定程度上得到改善[12-14]，但在擴(kuò)大皮瓣運(yùn)用面積效果方面并不理想。近年來，研究者們利用合適的載體，將外源性生長因子直接注射入皮瓣中遠(yuǎn)端，可有效提高小動(dòng)脈供血及毛細(xì)血管網(wǎng)的形成，降低了皮瓣的壞死率[15-16]。其中，腺病毒作為常見的載體。在轉(zhuǎn)染后的5～7 d，外源性基因蛋白的表達(dá)達(dá)到高峰，有效表達(dá)數(shù)周后消失。這種自限性能確保發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)活性，并避免由于長期的基因表達(dá)而導(dǎo)致的病理性腫瘤[9，17-18]。在此基礎(chǔ)上，本研究設(shè)想在術(shù)前7 d進(jìn)行術(shù)區(qū)注射，避免外源性基因高表達(dá)前，皮瓣末端已發(fā)生缺血性壞死。通過免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，術(shù)后初期，基因治療組皮瓣遠(yuǎn)端成活面積和再血管化均有明顯的改善。HE染色顯可見大量的新生微血管及成纖維細(xì)胞，同時(shí)VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)間的陽性表達(dá)及Western Blot的檢測結(jié)果表明皮瓣組織間生長因子濃度明顯增高，也證實(shí)了上述猜測。相關(guān)研究亦發(fā)現(xiàn)，于皮瓣缺血損傷前1周注射，使皮瓣遠(yuǎn)端有充足的時(shí)間構(gòu)建支持性血管[8]。本研究結(jié)合現(xiàn)有理論基礎(chǔ)，建立大鼠超比例隨意皮瓣動(dòng)物模型，術(shù)前7 d局部皮下注射Ad-HGF/VEGF165，論證基因聯(lián)合治療能有效提高并延長皮瓣移植術(shù)后局部生長因子生物學(xué)濃度，增強(qiáng)皮瓣遠(yuǎn)端血管新生和側(cè)支循環(huán)的形成，為突破隨意皮瓣長寬比例限制提供參考。

術(shù)后7 d觀測皮瓣存活面積，發(fā)現(xiàn)Ad-HGF/VEGF165組可顯著改善皮瓣遠(yuǎn)端的血運(yùn)，僅有少數(shù)邊緣區(qū)域組織缺血壞死。而Ad-VEGF165組皮瓣遠(yuǎn)端壞死相對嚴(yán)重。以往的研究中，Slobodkina E等[19]也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用后可明顯提高毛細(xì)血管生成數(shù)目及側(cè)支循環(huán)形成，微血管管腔長度增大，同時(shí)HGF與VEGF聯(lián)合應(yīng)用能更好的促進(jìn)ERK1/2蛋白的磷酸化。這與本研究結(jié)果一致。其機(jī)制可能是：①除HGF和VEGF通過各自途徑促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，HGF還可通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）誘導(dǎo)VEGF的分泌和表達(dá)，并在細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)VEGF的活性成倍增加[20-23]。②VEGF與HGF聯(lián)合應(yīng)用后，ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯高于單獨(dú)應(yīng)用一種因子時(shí)[19]。ERK1/2通過誘導(dǎo)特定蛋白的表達(dá)或活化，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和代謝[24-25]。在促進(jìn)糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)中抑制ERK1/2通路，發(fā)現(xiàn)血管生成數(shù)目、創(chuàng)面愈合速率明顯降低[26]。③基因聯(lián)合應(yīng)用能增強(qiáng)Rho的活性及Rac的調(diào)控，使皮瓣遠(yuǎn)端的新生血管與和創(chuàng)緣預(yù)先存在的血管網(wǎng)進(jìn)行功能性重塑，形成了新的小動(dòng)脈分支。同時(shí)HGF與VEGF聯(lián)合應(yīng)用可提高抗凋亡基因Bcl2和A1的mRNA水平，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織嚴(yán)重缺血和炎性反應(yīng)環(huán)境中的存活能力[27-29]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HGF和VEGF165聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)ERK1/2蛋白的磷酸化和VEGF-A的分泌與表達(dá)，并且術(shù)前7 d注射使受損組織有充足的時(shí)間構(gòu)建支持性血管，從而有效改善術(shù)后早期皮瓣中遠(yuǎn)端成活能力。但是，其協(xié)同效應(yīng)的機(jī)制仍需更深入研究。雖然目前尚無關(guān)于兩種基因聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)的適當(dāng)藥物劑量和注射時(shí)間的可復(fù)制性數(shù)據(jù)，以確?；颊咧委熀蟮拈L期安全性，但在促進(jìn)血管新生和改善皮瓣存活方面，基因治療仍是值得期待的研究方向。

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[收稿日期]2022-10-28

本文引用格式：趙毅，閆洪偉，王玉琦，等.腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子/血管內(nèi)皮生長因子165對大鼠超比例隨意皮瓣成活影響及機(jī)制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2024，33（2）：60-63，97.