槲皮素對心肌缺血后線粒體能量代謝功能的影響Δ

王盼盼，楊贊，劉冬蘭，周怡 （青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016）

心血管疾病是全球范圍內(nèi)造成死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響了人們的生存和生活質(zhì)量。缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）在心血管疾病中所占比例較高，是臨床上常見病種，其主要臨床表現(xiàn)為心肌梗死，近年來IHD的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢[1]。正常心肌細(xì)胞中，線粒體可通過提供腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）維持心肌細(xì)胞活力和功能，而心肌缺血會嚴(yán)重影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，致使ATP供應(yīng)不足，從而影響心肌功能[2]；阻塞的冠狀動脈再灌注還可進一步導(dǎo)致線粒體相關(guān)的氧化損傷、細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)[3]。因此，研究心肌缺血后線粒體的能量代謝對于IHD治療藥物的研發(fā)至關(guān)重要。

藥用植物被認(rèn)為是天然的小分子庫和新藥發(fā)現(xiàn)的重要資源。槲皮素作為天然的植物化合物，在植物界分布廣泛，主要存在于蘋果、漿果、洋蔥、蘆筍等水果和蔬菜中，由于其具有強大的抗氧化活性，引起了植物醫(yī)學(xué)和中藥研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。槲皮素是類黃酮家族成員之一，具有顯著的心臟益處，研究表明其可能通過降低血壓、抗氧化、干擾腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和改善內(nèi)皮依賴性患者的血管功能來改善心血管疾病[4]?；诖?，本研究通過構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧模型和大鼠急性心肌缺血模型探討了槲皮素對心肌缺血后心肌細(xì)胞線粒體代謝功能的影響，以期為治療IHD提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CytoFLEX型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）、XB120A型電子分析天平（瑞士Precisa公司）、ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Bio-Tek公司）、ECLIPSE Ti-s型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）、TG16-WS型高速臺式離心機（長沙湘儀離心機儀器公司）、TDL-50B型低速臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）、MCO-15AC-SC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）。

1.2 主要藥品與試劑

環(huán)孢菌素A（批號C106893，純度98%）、槲皮素（批號BD105676，純度99%）均購自河南奧科標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)科技有限公司；鹽酸曲美他嗪（批號22329-76-6，純度97%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；ATP檢測試劑盒（批號ml059183）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（批號B040100）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號11995-065）、胎牛血清（批號10099-141）均購自美國Gibco公司；線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（批號40706ES60）購自上海翊圣生物科技有限公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液（100×）、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒（批號分別為C0201、C0222、C2009S、S0033）均購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號分別為A032-1-1、A020-2-2、A003-1-1）均購自南京建成生物科技有限公司；肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、大鼠線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ（complex Ⅰ）和complex Ⅳ均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞與動物

大鼠H9c2心肌細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。48只SPF級的健康SD雄性大鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0028。動物實驗根據(jù)青海省西寧市實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)進行操作。

2 方法

2.1 細(xì)胞實驗

2.1.1 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng)

將H9c2心肌細(xì)胞置于含1%青霉素-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在5% CO2、飽和濕度、37 ℃的條件下培養(yǎng)。

2.1.2 細(xì)胞分組、造模與給藥

按前期實驗結(jié)果設(shè)置給藥劑量。實驗分為空白組、模型組、陽性對照組和槲皮素高、中、低劑量組，每組3個復(fù)孔。空白組細(xì)胞不做任何處理，正常培養(yǎng)2 h；模型組細(xì)胞重懸后，接種于24孔板中，待細(xì)胞融合度為80%時置于復(fù)合成分緩沖液（20 mmol/L 2-脫氧-D-葡萄糖、0.9 mmol/L CaCl2、12 mmol/L KCl、20 mmol/L 羥乙基哌嗪乙硫磺酸、137 mmol/L NaCl、0.5 mmol/L MgCl2，pH 6.2）中，并于含95% N2、0.1% O2、5% CO2、37 ℃的條件下放置1 h誘導(dǎo)缺氧[5]；陽性對照組細(xì)胞造模前加入1 μmol/L的環(huán)孢菌素A預(yù)處理1 h，再缺氧處理1 h；槲皮素高、中、低劑量組細(xì)胞先用40、20、10 μmol/L的槲皮素預(yù)處理1 h，再缺氧處理1 h。結(jié)束后，收集各組細(xì)胞及其上清液用于后續(xù)檢測。

2.1.3 H9c2心肌細(xì)胞中ROS的檢測

使用胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至離心管中，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹打均勻后計算細(xì)胞懸液的密度。將細(xì)胞密度達(dá)5×104個/mL左右的細(xì)胞懸液接種至6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞按照“2.1.2”項下方法分組處理后，使用胰酶消化細(xì)胞，加入DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸液，以3 500 r/min離心10 min后收集細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，離心，收集細(xì)胞沉淀，每管加入100 μL ROS檢測染色液，以37 ℃培養(yǎng)30 min后離心，收集細(xì)胞；使用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞3次，再用200 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進行ROS熒光強度定量檢測。熒光強度值越大，表明細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS越多。

2.1.4 H9c2心肌細(xì)胞MMP的檢測

將細(xì)胞接種至無菌6孔板中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞按照“2.1.2”項下方法分組處理后，用無血清DMEM/F12洗滌3次，常規(guī)胰酶消化，收集細(xì)胞，加入用二甲基亞砜配制的JC-1（10 μg/mL）探針，在37 ℃恒溫孵箱中孵育20 min，再用無血清DMEM/F12洗滌3次，用500 μL無血清DMEM/F12重懸，避光送檢，進行流式細(xì)胞儀檢測。在健康線粒體中，JC-1在基質(zhì)中發(fā)生聚合，形成明顯的紅色熒光，而受損的線粒體會隨著膜電位的降低而丟失，并產(chǎn)生綠色熒光。通過熒光顏色可觀察MMP的變化，紅/綠色熒光強度比值減小，說明細(xì)胞MMP下降。

2.1.5 H9c2心肌細(xì)胞MPTP開放程度的檢測

按“2.1.3”項下方法處理并收集細(xì)胞后，加入200 μL熒光淬滅工作液，混勻，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，以1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，使用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再用200 μL磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀進行MPTP熒光強度定量檢測。綠色熒光越強則說明開放程度越低，綠色熒光越弱則說明開放程度越高。

2.1.6 H9c2心肌細(xì)胞上清液中生化指標(biāo)的檢測

按“2.1.3”項下方法處理并收集細(xì)胞上清液后，采用雙抗體夾心法測定ATP含量，采用硫代巴比妥酸法（TBA法）測定MDA含量，依據(jù)酶促反應(yīng)原理測定LDH含量，采用微量酶標(biāo)法測定CK含量，具體步驟均按照試劑盒說明書操作。

2.2 動物實驗

2.2.1 大鼠分組與造模

按照前期實驗結(jié)果設(shè)置給藥劑量。大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，槲皮素高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg）和陽性對照組（曲美他嗪6.3 mg/kg），每組8只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，按體重每100 g灌胃相應(yīng)藥物1 mL，每天1次，連續(xù)7 d。大鼠末次給藥2 h后結(jié)扎冠狀動脈左前降支復(fù)制急性心肌缺血模型：麻醉大鼠，固定背部，連接呼吸機輔助呼吸，設(shè)置呼吸頻率每分鐘60次，呼吸比1∶1，潮氣量3 mL/kg。大鼠胸部去毛消毒后，沿著心臟方向剪開皮膚，用止血鉗分離肌肉，打開肋骨，沿著打開的肋骨使用擴胸器擴寬，找到心臟并剝離心包膜，從左心耳邊緣進針、肺動脈圓錐處下1 mm出針進行結(jié)扎，使用縫合線快速縫合胸腔和皮膚，并再次消毒，等大鼠恢復(fù)自主呼吸后關(guān)閉呼吸機電源，放于籠內(nèi)飼養(yǎng)[6]。

2.2.2 大鼠血清中心肌損傷和抗氧化指標(biāo)的檢測

造模24 h后，從大鼠頸總動脈采集血液，以10 000 r/min離心10 min，收集血清，按試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中LDH、MDA、CK-MB和SOD的含量。

2.2.3 大鼠血清中線粒體指標(biāo)的檢測

取“2.2.2”項下大鼠血清，按試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中complex Ⅰ、complex Ⅳ和ATP的含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Graph Pad Prism 5.0和SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 槲皮素對H9c2心肌細(xì)胞中ROS的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中ROS熒光強度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組細(xì)胞中ROS熒光強度均顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果見圖1和圖2。

圖1 各組細(xì)胞中ROS的流式細(xì)胞圖

圖2 各組細(xì)胞中ROS定量檢測結(jié)果（n＝3）

3.2 槲皮素對H9c2心肌細(xì)胞MMP的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞MMP的紅/綠色熒光強度比值顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組細(xì)胞MMP的紅/綠色熒光強度比值均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖3和圖4。

圖3 各組細(xì)胞MMP的流式細(xì)胞圖

圖4 各組細(xì)胞MMP定量檢測結(jié)果（n＝3）

3.3 槲皮素對H9c2心肌細(xì)胞MPTP開放程度的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞MPTP的綠色熒光強度顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組細(xì)胞MPTP的綠色熒光強度均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見圖5和圖6。

圖6 各組細(xì)胞MPTP定量檢測結(jié)果（n＝3）

3.4 槲皮素對H9c2心肌細(xì)胞上清液中生化指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞上清液中CK、LDH和MDA含量均顯著升高，ATP含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組細(xì)胞上清液中CK、LDH和MDA含量均顯著降低，ATP含量均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組細(xì)胞上清液中CK、LDH、MDA和ATP含量比較（±s，n＝3）

表1 各組細(xì)胞上清液中CK、LDH、MDA和ATP含量比較（±s，n＝3）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組槲皮素高劑量組槲皮素中劑量組槲皮素低劑量組陽性對照組CK/（U/mL）0.17±0.06 0.64±0.11a 0.41±0.15b 0.39±0.22b 0.31±0.11b 0.37±0.21b LDH/（U/L）67.89±13.30 265.30±8.49a 83.23±8.36b 87.23±8.44b 80.74±9.89b 96.47±8.67b MDA/（nmol/mL）1.01±0.16 4.99±0.24a 2.79±0.85b 2.38±0.17b 2.19±0.49b 2.50±0.60b ATP/（nmol/L）3 938.00±126.70 668.10±23.00a 3 132.00±13.42b 3 234.00±9.66b 3 348.00±173.40b 3 182.00±87.60b

3.5 槲皮素對大鼠心肌損傷和抗氧化指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA含量均顯著升高，SOD含量顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠血清中CK-MB、LDH和MDA含量均顯著降低，SOD含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 大鼠各組大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD含量比較（±s，n＝8）

表2 大鼠各組大鼠血清中CK-MB、LDH、MDA和SOD含量比較（±s，n＝8）

a：與假手術(shù)組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

SOD/（U/mL）151.00±9.46 111.60±7.62a 140.90±12.47b 135.10±12.59b 133.00±10.75b 130.30±11.07c組別假手術(shù)組模型組槲皮素高劑量組槲皮素中劑量組槲皮素低劑量組陽性對照組CK-MB/（U/L）0.81±0.13 2.50±0.36a 1.51±0.16b 1.52±0.15b 1.53±0.16b 1.43±0.33b LDH/（U/L）599.70±54.83 915.90±46.19a 755.60±67.13b 601.20±87.69b 713.50±126.00b 802.40±96.82b MDA/（nmol/mL）9.63±2.20 17.63±2.07a 12.13±2.80b 12.63±2.56b 12.38±2.50b 11.88±3.00b

3.6 槲皮素對大鼠血清中線粒體指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中complex Ⅰ、complex Ⅳ和ATP含量均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組和陽性對照組大鼠血清中complex Ⅰ、complex Ⅳ和ATP（陽性對照組除外）含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖7。

圖7 各組大鼠血清中線粒體指標(biāo)的檢測結(jié)果（n＝8）

4 討論

槲皮素存在于多種植物中，對心血管系統(tǒng)具有顯著的保護作用，可以改善心臟功能、減少心肌肥厚、防止血栓形成、擴張血管、降低血脂等[7]。既往對槲皮素保護心血管系統(tǒng)的研究多集中于心肌缺血再灌注這一領(lǐng)域，而對槲皮素抗心肌缺血以及如何影響線粒體功能方面研究較少。本研究在已有文獻的基礎(chǔ)上從細(xì)胞實驗和動物實驗兩個層面入手，探討了槲皮素對心肌缺血后線粒體能量代謝的影響，這與開發(fā)對線粒體功能具有保護作用的抗心肌缺血藥物這一熱點相契合，具有一定的創(chuàng)新性。

ROS在許多心血管疾病中起著至關(guān)重要的作用。MDA是ROS增加產(chǎn)生的有毒物質(zhì)之一，同時也是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，被認(rèn)為是反映細(xì)胞損傷的指標(biāo)之一。SOD是主要的線粒體抗氧化酶，可以加速ROS的清除，從而避免細(xì)胞遭受ROS的損害。MDA能與過量的氧自由基一起攻擊細(xì)胞膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死；此外，SOD和MDA在機體內(nèi)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，能夠極大限度地控制ROS水平，保持細(xì)胞正常功能，因此MDA和SOD常常被用來反映ROS含量，可用于評估氧化應(yīng)激程度[8]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素高、中、低劑量組細(xì)胞中MDA含量和ROS熒光強度均顯著低于模型組，槲皮素高、中、低劑量組大鼠血清中MDA含量均顯著低于模型組，SOD含量均顯著高于模型組，說明槲皮素能較好地清除自由基，降低機體氧化應(yīng)激損傷。

CK是一個與細(xì)胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，其主要作用是可逆性地催化肌酸和ATP生成磷酸肌酸和二磷酸腺苷，是評估心臟損傷的一個重要指標(biāo)。CK-MB是CK的同工酶，其能保持細(xì)胞膜的完整性，限制心肌酶的釋放，同時對心肌細(xì)胞的損傷程度具有高度特異性和敏感性。LDH是無氧糖酵解的終產(chǎn)物，心肌缺血后的無氧呼吸會促使LDH大量產(chǎn)生，故LDH也是心肌損傷的標(biāo)志酶之一[9-10]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素高、中、低劑量組細(xì)胞中LDH和CK含量均顯著低于模型組，其中槲皮素高、中劑量可能對細(xì)胞的損害較大導(dǎo)致低劑量的效果反而更好；槲皮素高、中、低劑量組大鼠血清中CK-MB和LDH含量均顯著低于模型組，說明槲皮素能保持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少LDH、CK和CK-MB的漏出，對受損的心肌細(xì)胞提供一定的保護作用。

ATP的合成情況可直接反映線粒體功能，缺血會造成線粒體功能嚴(yán)重受損，并導(dǎo)致ATP生成受阻。MPTP是線粒體的活性調(diào)節(jié)中樞，對于能量代謝的調(diào)控十分重要，氧化應(yīng)激會促使其開放，導(dǎo)致MMP下降，故MMP可快速準(zhǔn)確地反映線粒體功能[11-12]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組細(xì)胞中ATP含量均顯著升高，MPTP開放程度均顯著降低，并升高MMP，說明槲皮素可誘導(dǎo)心肌內(nèi)源性能量的產(chǎn)生，對心臟起到良好的保護作用。

complex Ⅰ是線粒體電子傳遞過程的第一個酶，也是氧化應(yīng)激反應(yīng)中ROS的主要來源，同時complex Ⅰ的電子傳遞是細(xì)胞中產(chǎn)生能量的重要途徑；complex Ⅳ又稱細(xì)胞色素C氧化酶，處于整個電子傳遞鏈的末端，負(fù)責(zé)將電子從complex Ⅲ上的細(xì)胞色素C傳遞至氧氣，生成水，負(fù)責(zé)細(xì)胞的大部分能量生產(chǎn)[13]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，槲皮素高、中、低劑量組大鼠血清中的complex Ⅰ、complex Ⅳ和ATP含量均顯著升高，說明槲皮素能提高線粒體復(fù)合酶的活性，促進ATP的生成。

綜上所述，槲皮素能有效減輕心肌缺氧損傷，促進內(nèi)源性能量的生成，改善心肌缺血后線粒體功能。本研究可為后續(xù)發(fā)掘更多天然抗心肌缺血藥物提供思路。