苦參醇F對潰瘍性結腸炎小鼠的干預作用Δ

何旭東，倪皓雨，何金彪，李敏，胡蘊鎧，龔弟鴻，姚金鈴，俞捷 ，楊興鑫 （云南中醫藥大學中藥學院，昆明 650500）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結腸黏膜連續性炎癥累積為特征的炎癥性腸病，以血性腹瀉為主要臨床癥狀，還包括腹痛、便血、體重減輕、里急后重、嘔吐等其他癥狀[1]，嚴重影響患者的生活質量。目前，UC的主要治療藥物是抗炎藥物和免疫調節藥物，這些藥物雖可緩解UC癥狀，但長期服用會導致患者皮膚壞死、血小板減少、造血功能抑制等[2]。因此，有必要尋找新的UC治療策略。

研究表明，抑制炎癥反應、促進腸道黏膜愈合可有效緩解UC[3]。苦參醇F（kushenol F，KSC-F；結構式見圖1）是中藥苦參的特征性成分，屬異戊烯基黃酮類，有抗菌、抗腫瘤、抗炎等藥理活性[4]，具有良好的開發前景。研究表明，10 mg/kg的KSC-F可通過降低核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的磷酸化水平以及NF-κB抑制因子激酶（inhibitor of NF-κB kinase，IKK）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6的mRNA表達水平來抑制炎癥反應，從而緩解炎癥相關癥狀[5]。UC屬于慢性炎癥性腸道疾病，炎癥反應是其發展和惡化的重要機制之一，抑制炎癥反應、減輕炎癥損傷是治療UC的關鍵，但KSC-F能否通過抑制結腸炎癥相關蛋白的表達來抑制炎癥反應，進而發揮抗UC作用尚不清楚。為此，本研究擬初步探究KSC-F對UC的干預作用，以期為UC治療新藥的先導化合物的開發提供參考。

圖1 KSC-F的結構式

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SpectraMax?Plus 384型光吸收酶標儀（美國Molecular Devices公司），Eclipse E100型正置光學顯微鏡、Nikon DS-Ri1-U3型數碼顯微成像系統（日本Nikon公司），LightCycler?96型實時熒光定量（PCR）儀購自瑞士Roche公司，ChemiDoc XRS型化學發光成像系統[賽默飛世爾（中國）科技有限公司]，RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），JB-P5型組織包埋機（武漢俊杰電子有限公司），KD-P型組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司），Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

KSC-F對照品（貨號JOT-10801，純度＞98%）購自成都普菲德生物技術有限公司；柳氮磺吡啶腸溶片（批號09221203，規格0.25 g）購自上海信誼天平藥業有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS；貨號160110）產自美國MP Biomedicals公司，購自廣州億寧生物技術有限公司；IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒均購自江蘇酶聯生物科技有限公司；兔源IL-1β、叉頭框蛋白O1（forkhead box O1，FOXO1）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、p38促分裂原活化的蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38 MAPK）、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（貨號分別為26048-4-AP、18592-1-AP、20584-1-AP、14064-1-AP、28796-1-AP、66444-1-lg、20536-1-AP）均購自美國Proteintech公司；兔源磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）抗體（貨號17366S）購自美國Cell Signaling Technology公司；蛋白定量試劑盒（BCA法）、RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術股份有限公司；環保型脫蠟液、通用型組織固定液、蘇木精-伊紅（HE）染液套裝均購自武漢塞維爾生物科技有限公司；實時聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR）檢測試劑盒購自賽默飛世爾（中國）科技有限公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、5%脫脂奶粉、10×電轉液、10×TBST緩沖液、5×Tris甘氨酸-電泳緩沖液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠，體重20～22 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0010。所有動物均飼養于溫度18～22 ℃、相對濕度50%～60%、每12 h光明/黑暗交替的環境下，自由攝食、飲水，經適應性喂養1周后進行后續實驗。本研究方案經云南中醫藥大學動物實驗倫理審查委員會審批，批件號為R-062023111。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只小鼠隨機分為5組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、KSC-F 50 mg/kg組（KSC-F50組）、KSC-F 100 mg/kg組（KSC-F100組），每組6只。除正常組小鼠飲用水外，其余各組小鼠均飲用3%DSS水溶液，連續7 d；與此同時，KSC-F50、KSC-F100組小鼠分別灌胃KSCF 50、100 mg/kg，陽性對照組小鼠灌胃柳氮磺吡啶703 mg/kg，正常組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續10 d。KSC-F的劑量參考Jo等[5]的研究；柳氮磺吡啶的劑量則根據成人（體重70 kg）臨床劑量換算而得；所有灌胃藥液均以N，N-二甲基乙酰胺（2.5%）+吐溫80（2.5%）+生理鹽水（95.0%）的混合溶液為溶劑。

2.2 一般情況觀察及疾病活動指數計算

實驗期間，于每天給藥前稱定并記錄各組小鼠體重，觀察其糞便排泄情況。于末次給藥后、采樣前，參照相關文獻方法[6]計算各組大鼠的疾病活動指數（disease activity index，DAI），DAI＝（體重減少比例評分+糞便出血評分+糞便硬度評分）/3。各項具體評分標準如表1所示，DAI評分＞0.5表明UC模型復制成功[6]。

表1 DAI評分標準

2.3 樣本采集

末次給藥后，各組小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）進行麻醉，于眼眶取血，血樣在室溫下放置1 h后，在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，分離上層血清，備用。取血后，各組小鼠以頸椎脫位法處死，打開腹腔，完整取出其結腸組織，測量結腸長度后，部分結腸組織用4%多聚甲醛溶液固定，用于病理形態觀察；另一部分結腸組織于－80 ℃下保存，用于后續指標檢測。

2.4 結腸組織病理形態觀察

取“2.3”項下固定的各組小鼠結腸組織適量，經乙醇逐級脫水、二甲苯透明后，行常規石蠟包埋、切片。切片烘干后行脫蠟及乙醇脫水處理，再依次用蘇木精、伊紅染液染色，經二甲苯透明后，以中性樹膠封片，使用光學顯微鏡進行病理形態觀察及圖像采集。

2.5 血清及結腸組織中炎癥因子水平檢測

取“2.3”項下各組小鼠血清樣品適量，按相應試劑盒說明書方法操作，以酶標儀檢測血清中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平。取“2.3”項下各組小鼠凍存的結腸組織適量，加入磷酸鹽緩沖液（pH7.4），勻漿，于4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，以BCA法定量后，按相應試劑盒說明書方法操作，以酶標儀檢測結腸組織中IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、TNF-α水平。

2.6 結腸組織中炎癥因子mRNA表達水平檢測

采用RT-PCR法檢測。取“2.3”項下凍存的正常組、模型組、KSC-F50組、KSC-F100組小鼠結腸組織各適量，利用Trizol試劑提取其總RNA并逆轉錄為cDNA，再以所得cDNA為模板進行PCR擴增。總反應體積為20 μL，包括SYBR Premix Ex TaqⅡ（9 μL）、上游引物（0.3 μL）、下游引物（0.3 μL）、cDNA模板（2 μL）和ddH2O（8.4 μL）。反應條件如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，62 ℃退火和延伸20 s，共40個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，采用2－ΔΔCt法計算目的基因mRNA的表達水平。各目的基因PCR擴增的引物序列和產物長度見表2。

表2 各目的基因PCR擴增的引物序列和產物長度

2.7 結腸組織中炎癥相關蛋白表達水平檢測

采用Western blot法檢測。取“2.3”項下凍存的正常組、模型組、KSC-F50組、KSC-F100組小鼠結腸組織各適量，加入RIPA裂解液，于4 ℃下研磨后，再于冰上放置30 min，以3 500 r/min離心15 min，收集上清液，以BCA法定量后作變性處理。取變性后的蛋白樣品適量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉；洗膜后，加入IL-1β、FOXO1、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK、p-Akt、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育2 h；洗膜3次，利用化學發光酶標底物顯色后，置于化學發光成像系統下成像。以β-actin為內參，使用Image J軟件分析各目的蛋白的條帶灰度值，以目的蛋白與內參的灰度值比值表示目的蛋白的表達水平。

2.8 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件對數據進行統計分析。數據均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 KSC-F對UC小鼠一般情況及結腸組織病理形態的影響

在飲用DSS水溶液后，模型組小鼠的體重整體呈下降趨勢，DAI評分較正常組顯著升高（P＜0.01）且超過0.5；結腸較正常組顯著縮短（P＜0.01），結腸組織的隱窩結構大量受損，杯狀細胞明顯減少，炎癥細胞浸潤嚴重。經藥物干預后，各藥物組小鼠體重減輕的情況有所改善，DAI評分均較模型組顯著降低（P＜0.01）；同時，小鼠結腸均較模型組顯著延長（P＜0.01），結腸組織的隱窩結構形態得到明顯改善，且可見大量杯狀細胞，炎癥細胞浸潤情況亦有所減輕。結果見圖2。

圖2 KSC-F對UC小鼠一般情況及結腸組織病理形態的影響

3.2 KSC-F對UC小鼠血清及結腸組織中炎癥因子水平的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.01），抗炎因子IL-10雖有下降但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各藥物組血清IL-1β、IL-6（KSC-F50組除外）、IL-8、TNF-α水平均顯著降低，IL-10水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖3。

圖3 KSC-F對UC小鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）

與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），抗炎因子IL-10雖有下降但差異無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各藥物組小鼠結腸組織中IL-1β（陽性對照組除外）、IL-6、IL-17、TNF-α（陽性對照組、KSC-F100組除外）水平均顯著降低，IL-10水平（陽性對照組除外）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），IL-8雖有下降但差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖4。

圖4 KSC-F對UC小鼠結腸組織中炎癥因子水平的影響（±s，n＝6）

3.3 KSC-F對UC小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-17、TNF-α mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.01），IL-6 mRNA雖有升高、IL-10 mRNA雖有下降，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，各藥物組小鼠結腸中IL-1β（KSC-F50除外）、IL-17、TNF-α（KSC-F50除外）mRNA的表達水平均顯著降低（P＜0.01），IL-6、IL-10 mRNA的表達雖有回調但差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖5。

圖5 KSC-F對UC小鼠結腸組織中炎癥因子mRNA表達的影響（±s，n＝6）

3.4 KSC-F對UC小鼠結腸組織中炎癥相關蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠結腸組織IL-1β、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達水平雖有升高，FOXO1蛋白的表達水平雖有降低，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，KSC-F100組小鼠結腸組織中p-Akt、p-PI3K、p-p38 MAPK蛋白的表達水平均顯著降低，FOXO1蛋白的表達水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖6。

圖6 KSC-F對UC小鼠結腸組織中炎癥相關蛋白表達的影響

4 討論

UC的典型臨床癥狀包括大便出血、腹瀉和體重減輕[1]。目前，UC的發病原因尚不明確，但可能與自身免疫、遺傳、感染和過敏等因素有關[2]。UC的病理特征為存在于結腸黏膜至直腸近端的持續性、彌散性炎癥[7]。此外，在發病過程中，PI3K/Akt信號通路及FOXO-1、IL-1β、p38 MAPK蛋白被激活，進而促進中性粒細胞和巨噬細胞釋放炎癥因子，引發炎癥反應；炎癥反應又導致結腸黏膜血管擴張、血管通透性增加，血液和免疫細胞滲入組織間隙，從而引起組織水腫、纖維化和潰瘍形成[8-11]。可見，控制炎癥反應、減輕炎癥損傷是治療UC的關鍵。柳氮磺吡啶是臨床治療UC的常用藥物，其抗炎活性確切，故被選作本研究的陽性對照藥物。

在結腸炎癥中，促炎因子TNF-α上調會破壞結腸上皮屏障，促進IL-6、IL-1β產生；與此同時，作為抗炎因子的IL-10則可維持胃腸道穩態[12]。KSC-F是從苦參中發現的一種異戊烯基黃酮類成分，已被證實具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等藥理活性[4-5]。本研究結果顯示，50、100 mg/kg的KSC-F可改善UC小鼠體重減輕的情況，顯著降低DAI評分，顯著增加結腸長度及結腸組織中杯狀細胞數量，改善隱窩結構形態，減輕炎癥細胞浸潤，能不同程度地降低模型小鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和結腸組織中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α水平，以及結腸組織中IL-1β、IL-17、TNF-α mRNA的表達水平，提示KSCF具有改善UC小鼠結腸組織病變和炎癥反應的作用。

PI3K的激活可活化Akt，從而促進炎癥細胞的激活和炎癥因子的產生[8]。此外，活化的Akt可負反饋調節FOXO1的表達，從而進一步增加IL-1β的表達，而IL-1β可進一步激活p38 MAPK，從而加劇炎癥反應[13-15]。研究表明，MHY2013可通過抑制Akt和p38 MAPK的激活，增加FOXO1蛋白的表達，抑制IL-1β的轉錄，從而減輕胰島素抵抗引起的炎癥反應，提示PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活與炎癥反應的發生發展密切相關[15]。本研究結果顯示，在DSS誘導的模型組小鼠中，其結腸組織中IL-1β、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白的表達雖較正常組有所上升，FOXO1蛋白的表達雖有所下降，但差異均無統計學意義。本課題組推測這些蛋白可能參與了UC的發生發展，但可能并非主要機制，有待進一步驗證。本研究結果還顯示，50、100 mg/kg的KSC-F能不同程度地下調p-Akt、p-PI3K、pp38 MAPK蛋白的表達，同時上調FOXO1蛋白的表達，提示KSC-F可通過抑制PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活，增加FOXO1蛋白的表達來緩解UC小鼠的炎癥反應。

柳氮磺吡啶已被廣泛應用于UC、克羅恩病和類風濕性關節炎等炎癥性疾病的臨床治療，成人用藥劑量為57 mg/（kg·d），按成人體重70 kg換算，小鼠給藥劑量為703 mg/（kg·d）。本研究結果證實，100 mg/（kg·d）的KSC-F對UC小鼠炎癥反應具有明顯的抑制作用，且劑量低于陽性對照藥，提示KSC-F的臨床有效劑量可能更低。

綜上所述，KSC-F可通過抑制PI3K、Akt、p38 MAPK蛋白的激活，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的釋放，促進抗炎因子IL-10的分泌，減輕結腸組織炎癥損傷，從而改善UC小鼠的相關癥狀。但KSC-F能否通過影響其他機制（如腸道微生物、體內免疫系統）來發揮抗UC作用仍有待后續研究深入探討。