胡黃連苷Ⅱ對非小細胞肺癌惡性進展的影響Δ

郭寰宇 ，王衛芳 ，徐麗偉 ，董文博 （1.長春中醫藥大學臨床醫學院實驗中心，長春 10117；2.長春中醫藥大學臨床醫學院生物化學教研室，長春 10117；.長春中醫藥大學附屬醫院腫瘤血液科，長春 10112；.吉林大學第一醫院二部檢驗科，長春 10061）

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌最普遍的組織學亞型，占所有肺癌病例的85%～90%[1]。目前，NSCLC的治療主要以西醫手段為主，包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等[2]。然而，這些治療通常伴有復發、轉移、患者預后差等不良結局，且治療成本較高等[3]。此外，諸多靶向藥物雖可延長晚期NSCLC患者的生存期，但耐藥性會嚴重影響其長期療效[4]。

研究表明，中醫藥對NSCLC的輔助治療或患者預后有促進作用，可減少不良反應的發生，并具有良好的耐受性[5]。胡黃連苷Ⅱ是中藥胡黃連提取物的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等作用[6]。已有研究報道，胡黃連苷Ⅱ可抑制人腎癌ACHN細胞的增殖并促進其凋亡[7]，還可抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲[8]。這提示胡黃連苷Ⅱ具有一定的抗腫瘤活性，但其能否抑制NSCLC的惡性進展尚不明確。相關研究顯示，抑制鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SPHK1）/1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）/1-磷酸鞘氨醇受體3（sphingosine-1-phosphate receptor 3，S1PR3）信號通路可抑制乳腺癌干細胞的增殖[9]，以及肺淋巴管肌瘤細胞的增殖與侵襲[10]。這提示SPHK1/S1P/S1PR3信號通路參與了腫瘤的進展，但胡黃連苷Ⅱ能否通過調節SPHK1/S1P/S1PR3信號通路來抑制NSCLC的惡性進展尚不清楚。基于此，本研究擬基于上述信號通路探究胡黃連苷Ⅱ對NSCLC惡性進展的影響及潛在機制，以期為NSCLC的治療藥物提供更多選擇。

1 材料

1.1 主要儀器

xMark型酶標儀、165-8001型蛋白電泳儀、Bio-Rad GelDoc XR+凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司；DM2500型熒光顯微鏡購自德國Leica公司；E100型光學顯微鏡購自日本Nikon公司；SCO2W-2型細胞培養箱購自美國SHELLAB公司。

1.2 主要藥品與試劑

胡黃連苷Ⅱ對照品（批號39012-20-9，純度≥98%）購自上海陌孚醫藥科技有限公司；K6PC-5對照品（SPHK1激活劑，批號SML1709，純度≥98%）購自北京百奧創新科技有限公司；CCK-8試劑盒（批號20220703）購自北京沃比森科技有限公司；5-乙炔基-2′-脫氧尿苷（EdU）染色試劑盒（批號CA1170）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9、SPHK1、S1PR3、胞外信號調節激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG二抗（批號分別為ab92552、ab92536、ab76003、ab302714、ab248131、ab184699、ab128915、ab6721）均購自英國Abcam公司；RPMI 1640培養基（批號R10-041）購自北京畢特博生物技術有限責任公司；電化學發光試劑（批號20221226）購自北京三品醫療科技有限公司。

1.3 實驗動物與細胞

SPF級雄性BALB/c裸鼠30只，5～6周齡，體重18.5～19.5 g，購自山東艾萊克生物科技有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）2022 0007。本研究方案獲得長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，批準編號為2021309。

人NSCLC細胞系A549購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞實驗

2.1.1 細胞培養及胡黃連苷Ⅱ干預濃度的篩選

取A549細胞，于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中培養。取對數生長期的A549細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，分別用0（對照組）、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的胡黃連苷Ⅱ處理24 h，并設置不含細胞、不含藥物的空白組（每個濃度設置6個復孔）；隨后，于每孔中加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃下孵育2 h，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，計算細胞存活率[細胞存活率＝（實驗組OD值－空白組OD值）/（對照組OD值－空白組OD值）×100%]，并將細胞存活率接近50%時對應的胡黃連苷Ⅱ濃度作為胡黃連苷Ⅱ干預的高濃度用于后續實驗。

2.1.2 細胞分組與處理

取對數生長期的A549細胞，隨機分為對照組，胡黃連苷Ⅱ低、中、高濃度組，K6PC-5組，胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組。各藥物濃度參考“2.1.1”項下結果及相關文獻[8，11]設定，具體處理過程如下：胡黃連苷Ⅱ低、中、高濃度組細胞分別用10、20、40 μmol/L的胡黃連苷Ⅱ處理24 h；K6PC-5組細胞用10 μmol/L的K6PC-5處理24 h；胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組細胞用40 μmol/L的胡黃連苷Ⅱ和10 μmol/L的K6PC-5共同處理24 h；對照組細胞正常培養24 h。

2.1.3 細胞增殖檢測

（1）CCK-8實驗：取對數生長期的A549細胞，以2×103個/孔接種于96孔板上，按照“2.1.2”項下方法分組（每組設6個復孔）、處理。隨后，于每孔中加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃下孵育2 h，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各孔的OD值，用以反映細胞增殖情況。

（2）EdU染色實驗：取對數生長期的A549細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，按照“2.1.2”項下方法分組（每組設6個復孔）、處理。隨后，于每孔中加入50 μmol/L的EdU染液適量，染色2 h；棄去染液，細胞以4%多聚甲醛固定1 h后，以阿波羅染液染色30 min，再以4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液染核20 min。使用熒光顯微鏡觀察，使用Image J軟件對EdU陽性細胞（呈綠色熒光）進行計數并按下式計算EdU陽性細胞率：EdU陽性細胞率＝EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。

2.1.4 細胞遷移能力檢測

采用劃痕實驗檢測。取對數生長期的A549細胞，以2×105個/孔接種于24孔板中，培養，待細胞鋪滿后，用無菌移液器槍頭在板內垂直劃線，用磷酸鹽緩沖液清洗后，將細胞按照“2.1.2”項下方法分組（每組設6個復孔）、處理。使用光學顯微鏡分別于處理0、24 h時觀察并測量各組細胞的劃痕寬度，并按下式計算劃痕愈合率：劃痕愈合率＝（0 h時的劃痕寬度－24 h時的劃痕寬度）/0 h時的劃痕寬度×100%。

2.1.5 細胞侵襲能力檢測

采用Transwell實驗檢測。取對數生長期的A549細胞，用不含血清的RPMI 1640培養基重懸至1×106個/mL，取上述細胞懸液100 μL置于Transwell上室，同時將含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基500 μL置于Transwell下室，培養24 h。將上層細胞按照“2.1.2”項下方法分組（每組設6個復孔）、處理。隨后，去除上室底部未穿膜的細胞，將侵襲細胞（即穿膜細胞）用4%多聚甲醛固定，再以0.1%結晶紫染液染色，使用光學顯微鏡觀察細胞侵襲情況并記錄侵襲細胞數。

2.1.6 細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白及SPHK1/S1P/S1PR3信號通路相關蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測。取對數生長期的A549細胞，以2×105個/孔接種于24孔板中，按照“2.1.2”項下方法分組（每組設6個復孔）、處理。隨后，收集各組細胞，裂解并提取其總蛋白。對蛋白進行定量、變性、電泳分離、轉膜、封閉后，加入PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2、GAPDH一抗（稀釋比例分別為1∶4 000、1∶4 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000），于4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應二抗（稀釋比例為1∶2 000），于室溫下孵育1.5 h；洗膜后，以電化學發光試劑顯影，再置于凝膠成像系統下成像。使用Image J軟件分析各蛋白的灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）的灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

2.2 移植瘤裸鼠實驗

取1×107個/mL的A549細胞懸液0.2 mL，皮下接種于BALB/c裸鼠腋窩，建立NSCLC移植瘤裸鼠模型（接種后第7天，若移植瘤長徑＞5 mm，則判定造模成功[12]）。取造模成功的裸鼠30只，隨機分為裸鼠-對照組，裸鼠-胡黃連苷Ⅱ低、中、高劑量組，裸鼠-K6PC-5組，裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量+K6PC-5組，每組5只。各藥物劑量參考預實驗結果及相關文獻[8，13]設定，具體處理過程如下：裸鼠-胡黃連苷Ⅱ低、中、高劑量組裸鼠分別腹腔注射25、50、100 mg/kg的胡黃連苷Ⅱ；裸鼠-K6PC-5組裸鼠腹腔注射0.007 5 mg/kg的K6PC-5；裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量+K6PC-5組裸鼠同時腹腔注射100 mg/kg的胡黃連苷Ⅱ和0.007 5 mg/kg的K6PC-5；裸鼠-對照組裸鼠腹腔注射生理鹽水。各組裸鼠均每天注射1次，持續30 d。30 d后，處死裸鼠，分離并收集其瘤體，稱定瘤體質量并按下式計算瘤體體積：腫瘤體積＝0.5×a×b2（式中，a為瘤體長徑，b為瘤體短徑）。

2.3 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。實驗數據以±s表示，多組間差異分析采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 細胞實驗結果

3.1.1 胡黃連苷Ⅱ干預濃度的篩選結果

隨著胡黃連苷Ⅱ濃度的升高，細胞存活率顯著降低（P＜0.05），且有一定的濃度依賴趨勢：在0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L胡黃連苷Ⅱ作用下，細胞存活率依次為（99.97±0.03）%、（97.78±0.12）%、（89.95±0.23）%、（80.55±0.36）%、（73.36±0.28）%、（65.57±0.23）%、（54.43±0.26）%、（43.94±0.22）%。因此，本研究選擇胡黃連苷Ⅱ 40 μmol/L作為后續干預的高濃度，以10、20 μmol/L作為后續干預的低、中濃度。

3.1.2 胡黃連苷Ⅱ對A549細胞增殖的影響

與對照組比較，胡黃連苷Ⅱ各濃度組的細胞OD450值、EdU陽性細胞率均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；而K6PC-5組的細胞OD450值、EdU陽性細胞率均顯著升高（P＜0.05）。與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組的細胞OD450值、EdU陽性細胞率均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1、圖1。

表1 各組A549細胞OD450值、EdU陽性細胞率比較（±s，n＝6）

表1 各組A549細胞OD450值、EdU陽性細胞率比較（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與胡黃連苷Ⅱ低濃度組比較，P＜0.05；c：與胡黃連苷Ⅱ中濃度組比較，P＜0.05；d：與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，P＜0.05。

EdU陽性細胞率/%58.86±2.37 50.69±2.15a 43.37±2.06ab 28.85±1.33abc 66.72±2.85a 46.65±2.17d組別對照組胡黃連苷Ⅱ低濃度組胡黃連苷Ⅱ中濃度組胡黃連苷Ⅱ高濃度組K6PC-5組胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組OD450值0.92±0.06 0.83±0.07a 0.71±0.06ab 0.44±0.03abc 1.21±0.11a 0.75±0.06d

圖1 各組A549細胞增殖的EdU染色顯微圖

3.1.3 胡黃連苷Ⅱ對A549細胞遷移的影響

與對照組比較，胡黃連苷Ⅱ各濃度組細胞的劃痕愈合率均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；而K6PC-5組細胞的劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）。與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組細胞的劃痕愈合率顯著升高（P＜0.05）。結果見表2、圖2。

表2 各組A549細胞劃痕愈合率變化比較（±s，n＝6）

表2 各組A549細胞劃痕愈合率變化比較（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與胡黃連苷Ⅱ低濃度組比較，P＜0.05；c：與胡黃連苷Ⅱ中濃度組比較，P＜0.05；d：與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，P＜0.05。

組別對照組胡黃連苷Ⅱ低濃度組胡黃連苷Ⅱ中濃度組胡黃連苷Ⅱ高濃度組K6PC-5組胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組劃痕愈合率/%62.23±2.96 54.43±2.68a 45.52±2.39ab 29.66±1.68abc 69.94±2.88a 48.87±2.35d細胞侵襲數/個86.65±3.84 75.86±3.16a 62.28±2.94ab 31.18±1.43abc 95.45±3.66a 67.73±2.88d

圖2 各組A549細胞遷移情況的顯微圖

3.1.4 胡黃連苷Ⅱ對A549細胞侵襲的影響

與對照組比較，胡黃連苷Ⅱ各濃度組的細胞侵襲數均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；而K6PC-5組的細胞侵襲數顯著升高（P＜0.05）。與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組的細胞侵襲數顯著升高（P＜0.05）。結果見表2、圖3。

圖3 各組A549細胞侵襲情況的顯微圖

3.1.5 胡黃連苷Ⅱ對A549細胞中相關蛋白表達的影響

與對照組比較，胡黃連苷Ⅱ各濃度組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的相對表達量均顯著降低，且呈濃度依賴性（P＜0.05）；而K6PC-5組細胞中上述蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）。結果見表3、圖4。

表3 各組A549細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

表3 各組A549細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白相對表達量比較（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與胡黃連苷Ⅱ低濃度組比較，P＜0.05；c：與胡黃連苷Ⅱ中濃度組比較，P＜0.05；d：與胡黃連苷Ⅱ高濃度組比較，P＜0.05。

ERK1/2 0.61±0.05 0.43±0.04a 0.34±0.03ab 0.14±0.01abc 0.94±0.08a 0.38±0.03d組別對照組胡黃連苷Ⅱ低濃度組胡黃連苷Ⅱ中濃度組胡黃連苷Ⅱ高濃度組K6PC-5組胡黃連苷Ⅱ高濃度+K6PC-5組PCNA 1.52±0.14 1.27±0.11a 1.01±0.08ab 0.63±0.05abc 1.87±0.16a 1.12±0.13d MMP-2 1.36±0.12 1.03±0.10a 0.81±0.08ab 0.52±0.05abc 1.69±0.14a 0.94±0.08d MMP-9 1.14±0.11 0.85±0.07a 0.62±0.05ab 0.31±0.03abc 1.33±0.12a 0.73±0.06d SPHK1 0.93±0.08 0.81±0.08a 0.64±0.06ab 0.27±0.03abc 1.21±0.13a 0.70±0.06d S1PR3 0.72±0.06 0.65±0.05a 0.51±0.04ab 0.30±0.03abc 0.89±0.08a 0.57±0.05d

圖4 各組A549細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白表達的電泳圖

3.2 胡黃連苷Ⅱ對裸鼠體內移植瘤生長的影響

與裸鼠-對照組比較，裸鼠-胡黃連苷Ⅱ各劑量組裸鼠體內的瘤體質量均顯著降低，體積均顯著縮小，且均呈劑量依賴性（P＜0.05）；而裸鼠-K6PC-5組裸鼠體內的瘤體質量顯著升高，體積顯著增大（P＜0.05）。與裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量組比較，裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量+K6PC-5組裸鼠體內的瘤體質量顯著升高，體積顯著增大（P＜0.05）。結果見圖5、表4。

表4 各組裸鼠體內腫瘤質量與體積變化比較（±s，n＝5）

表4 各組裸鼠體內腫瘤質量與體積變化比較（±s，n＝5）

a：與裸鼠-對照組比較，P＜0.05；b：與裸鼠-胡黃連苷Ⅱ低劑量組比較，P＜0.05；c：與裸鼠-胡黃連苷Ⅱ中劑量組比較，P＜0.05；d：與裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量組比較，P＜0.05。

腫瘤體積/mm3 158.33±6.14 135.42±5.84a 112.52±5.25ab 47.92±2.13abc 185.42±6.53a 118.75±5.03d組別裸鼠-對照組裸鼠-胡黃連苷Ⅱ低劑量組裸鼠-胡黃連苷Ⅱ中劑量組裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量組裸鼠-K6PC-5組裸鼠-胡黃連苷Ⅱ高劑量+K6PC-5組瘤體質量/g 0.76±0.06 0.65±0.05a 0.54±0.04ab 0.23±0.02abc 0.89±0.07a 0.57±0.04d

圖5 各組裸鼠體內移植瘤生長情況

4 討論

胡黃連苷Ⅱ是一種糖苷類衍生物，可抑制人食管癌Eca109細胞和人結直腸癌SW480、SW620細胞的增殖、侵襲與轉移[14-15]，提示該成分具有一定的抗腫瘤活性。本研究結果顯示，胡黃連苷Ⅱ可濃度/劑量依賴性地抑制A549細胞的增殖、遷移、侵襲以及裸鼠體內移植瘤的生長，表明該成分能夠抑制NSCLC的惡性進展。

作為細胞增殖的標志蛋白，PCNA對于腫瘤細胞的DNA復制至關重要[16]；MMP-2和MMP-9可降解細胞外基質并參與腫瘤細胞的侵襲和轉移，其表達水平與腫瘤細胞的侵襲、遷移能力成正比[17]。本研究檢測了A549細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況，結果顯示，胡黃連苷Ⅱ可濃度依賴性地抑制細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白的表達，從蛋白水平上初步證實了胡黃連苷Ⅱ對A549細胞增殖、侵襲、遷移的抑制作用。與此同時，本研究結果還顯示，胡黃連苷Ⅱ可劑量依賴性地抑制移植瘤裸鼠體內的腫瘤生長，從動物水平上初步證實了該成分對惡性腫瘤的體內抑制作用。由此可見，胡黃連苷Ⅱ有望成為NSCLC的潛在治療藥物之一。

由SPHK1產生的S1P是鞘脂代謝的中心分子，S1P可與S1PR3結合，進而激活S1P下游分子ERK1/2的表達，從而調節腫瘤細胞存活、遷移等生物學過程[10，18]；另有研究證實，SPHK1/S1P/S1PR3信號通路可參與卵巢癌細胞的血管生成[19]。以上研究表明，SPHK1/S1P/S1PR3信號通路在腫瘤的惡性進展中具有重要作用。此外，SPHK1/S1P/S1PR3信號通路中S1P的活化包括其受體（S1PR）及受體活化所引起的一系列細胞反應[20]，故可通過檢測SIPR3的表達來反映S1P的活性。鑒于此，本研究檢測了SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的表達情況。結果顯示，胡黃連苷Ⅱ可濃度依賴性地下調細胞中SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的表達，推測該成分對NSCLC惡性進展的抑制作用可能與抑制SPHK1/S1P/S1PR3信號通路有關。同時，本研究結果還顯示，經SPHK1激活劑K6PC-5干預后，細胞中SPHK1/S1P/S1PR3信號通路相關蛋白SPHK1、S1PR3、ERK1/2的表達均較對照組顯著升高，細胞的增殖、遷移、侵襲能力亦顯著增強，裸鼠體內移植瘤的生長明顯加快，表明SPHK1/S1P/S1PR3信號通路確實參與了NSCLC的惡性進展。為驗證上述推測，本研究在高劑量胡黃連苷Ⅱ的基礎上聯合該激活劑來干預A549細胞及移植瘤裸鼠，結果顯示，K6PC-5減弱了高劑量胡黃連苷Ⅱ對A549細胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用以及對裸鼠移植瘤生長的抑制作用，進一步證實了胡黃連苷Ⅱ抑制NSCLC惡性進展的作用可能是通過抑制SPHK1/S1P/S1PR3信號通路來實現的。

綜上所述，胡黃連苷Ⅱ可能通過抑制SPHK1/S1P/S1PR3信號通路來抑制NSCLC的惡性進展。但胡黃連苷Ⅱ抑制NSCLC惡性進展還可能涉及其他機制，還有待后續研究深入探討。