原花青素通過調節PI3K/Akt/VEGF信號通路對牙齦炎大鼠的作用機制研究Δ

殷曉寧 ，左憲宏 ，段麗云 ，周軍 （1.張家口學院護理學院，河北 張家口 075000；.張家口市第一醫院口腔科，河北 張家口 075000）

牙齦炎是一種慢性炎癥性口腔疾病，主要累及牙齦組織，若治療不及時，會深度破壞牙周結構，引發嚴重牙周炎，損害牙實質，導致牙齒松動脫落，極大地影響患者的咀嚼功能[1]。研究指出，牙齦炎的致病因素以口腔牙齦卟啉單胞菌感染為主，其病理改變包括牙齦組織的炎癥細胞浸潤和病理性血管生成激活，因此減輕炎癥是防治牙齦炎、維持口腔健康的有效手段[2]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）是調控炎癥因子表達及炎癥反應發生的重要信號通路，可參與介導牙齦炎等炎癥性疾病的發病過程，抑制該信號通路激活可降低炎癥因子的表達水平，并可下調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，抑制血管新生，減輕脂多糖誘導的人牙齦成纖維細胞的炎癥反應和過氧化損傷[3-4]。由此可見，PI3K/Akt/VEGF信號通路是牙齦炎的潛在治療靶點。

原花青素是一種黃酮類活性物質，富含于葡萄籽中，具有較強的抗氧化及抗炎能力。已有研究證實，原花青素可抑制人牙周膜成纖維細胞損傷和人牙齦上皮細胞炎癥因子的表達[5-6]。但上述研究僅從細胞角度探究了原花青素的抗炎效果，未能深入研究其對牙齦炎的改善作用及潛在機制?；诖耍狙芯客ㄟ^構建牙齦炎大鼠模型，初步探究原花青素對模型大鼠牙齦組織損傷及PI3K/Akt/VEGF信號通路的影響，以期為牙齦炎的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

JJ-Z029-2型牙周鈍頭探針儀購自覲嘉科學儀器（上海）有限公司；PT-3502B型酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司；Axiovert 200型顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司；Omega Fluor Plus型凝膠成像儀購自美國Aplegen公司。

1.2 主要藥品與試劑

原花青素原料藥（批號SY28349，純度≥99.65%）購自甘肅順意生物科技有限公司；麥芽糖、蔗糖（批號分別為JX108、JX117）均購自西安晉湘藥用輔料有限公司；白細胞介素18（interleukin-18，IL-18）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒和ECL增強化學發光試劑（批號分別為NB29840、NB46227、NB55258、NB44268）均購自深圳市紐邦生物技術有限公司；740Y-P原料藥（PI3K/Akt信號通路激活劑，純度≥98.95%），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）ELISA檢測試劑盒，蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒，高效RIPA裂解液，BCA蛋白檢測試劑盒（批號分別為WC29845、WC47811、WC55278、WC50755、WC25632、WC46147、WC77280）均購自南京微測生物科技有限公司；兔源磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）、PI3K、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、Akt、VEGF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（批號分別為JD29490、JD53814、JD32561、JD44783、JD45611、JD63326、JD42886）均購自南京基蛋生物科技股份有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，8～9周齡，體重322～351 g，購自廣東萊迪生物醫藥研究院有限公司，生產許可證號為SCXK（粵）2022-0064。所有大鼠均在室溫22～25 ℃、相對濕度55%～65%、每12 h晝夜循環的環境中飼養，自由飲水、攝食。本研究方案經張家口學院倫理委員會審核批準，批準編號為L2022第92號。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

參照相關文獻方法[7-8]建立牙齦炎大鼠模型：大鼠經乙醚麻醉后以仰臥位固定，用絲線縫扎其上頜雙側第1磨牙牙頸部，于牙齦上縫2針固定，在其牙齦處涂抹麥芽糖，每天3次，并以20%蔗糖溶液及軟食喂養；7 d后，觀察大鼠牙齦，若出現齦緣紅腫、光亮、松軟，觸碰易出血，并伴有明顯的牙齦組織病理改變（隨機取4只造模大鼠處死后觀察），則視為牙齦炎大鼠模型復制成功。將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、原花青素組、740Y-P組、原花青素+740Y-P組，每組12只；另選12只大鼠，不作任何處理并正常喂養，作為對照組。

原花青素組大鼠灌胃160 mg/kg的原花青素[9]（將原花青素以生理鹽水溶解制成質量濃度為16 mg/mL的混懸液，灌胃體積為10 mL/kg，下同）；740Y-P組大鼠腹腔注射0.02 mg/kg的740Y-P[10]（740Y-P以生理鹽水溶解制成質量濃度為0.002 mg/mL的溶液，注射體積為10 mL/kg，下同）；原花青素+740Y-P組大鼠灌胃160 mg/kg的原花青素，同時腹腔注射0.02 mg/kg的740Y-P；對照組和模型組大鼠灌胃10 mL/kg生理鹽水；每天1次，持續7 d。

2.2 大鼠牙齦指數的測定

末次給藥結束24 h后，各組大鼠經麻醉后使用鈍頭探針探診牙齦，參照以下標準測定牙齦指數：牙齦正常，記0分；牙齦有輕度炎癥和輕度水腫，顏色有輕度改變，探診不出血，記1分；牙齦有中度炎癥，水腫光亮、色紅，探診出血，記2分；牙齦有重度炎癥，有自動出血傾向，可見明顯紅腫或潰瘍，記3分[11-12]。

2.3 大鼠齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平的檢測及標本的采集

取2 mm×4 mm的濾紙條，插入大鼠兩下門齒齦溝內，60 s后取出并浸入生理鹽水0.5 mL中，振蕩60 s后，取出濾紙，使用ELISA法以酶標儀測定其中IL-18、iNOS、ALP水平（具體操作嚴格按照相應試劑盒說明書進行）。

隨后，各組大鼠經麻醉后斷頭處死，取其牙齦組織適量，轉移至高效RIPA裂解液中，勻漿，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，取上層蛋白樣品液，采用BCA法檢測蛋白濃度后，于－80 ℃下保存，備用；取大鼠剩余的牙齦組織，經水漂洗后，依次浸入80%～100%的乙醇中脫水，以二甲苯透明后，行常規石蠟包埋、切片（厚度約4 μm），備用。

2.4 大鼠牙齦組織病理形態的觀察

取“2.3”項下各組大鼠的牙齦組織切片，經二甲苯脫蠟、乙醇水化后，進行HE染色（具體操作按照相應試劑盒說明書進行），經脫水、透明后封片，使用顯微鏡觀察其牙齦組織的病理形態，并任選5個視野拍照。

2.5 大鼠牙齦組織中SOD、CAT、ROS水平的檢測

取“2.3”項下凍存的各組大鼠牙齦組織蛋白樣品液適量，于4 ℃下融化后，取適量，采用ELISA法以酶標儀測定其中SOD、CAT、ROS水平（具體操作按照相應試劑盒說明書進行）。

2.6 大鼠牙齦組織中PI3K/Akt/VEGF信號通路相關蛋白表達的檢測

取“2.3”項下凍存的各組大鼠剩余的牙齦組織蛋白樣品液，煮沸5 min使變性；取變性蛋白適量，于120 V電壓下電泳70 min，再以濕轉法（110 V，90 min）轉移到硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、VEGF、GAPDH（內參）一抗（稀釋度均為1∶2 500），于4 ℃下孵育12 h；以TBST緩沖液洗滌5 min×3次，加入相應二抗（稀釋度為1∶2 700），于室溫下孵育2 h；以TBST緩沖液洗滌5 min×3次，用ECL顯色后，于凝膠成像儀下成像。運用Image J軟件定量分析各蛋白的條帶灰度值，并以此計算VEGF蛋白的表達水平（VEGF/GAPDH）和PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平（p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt）。

2.7 統計學方法

應用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 原花青素對牙齦炎大鼠牙齦指數的影響

與對照組比較，模型組大鼠牙齦指數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素組大鼠牙齦指數顯著降低（P＜0.05），740Y-P組大鼠牙齦指數顯著升高（P＜0.05）；與原花青素組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦指數顯著升高（P＜0.05）；與740Y-P組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦指數顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠牙齦指數和齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平比較（±s，n＝12）

表1 各組大鼠牙齦指數和齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平比較（±s，n＝12）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與原花青素組比較，P＜0.05；d：與740Y-P組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組原花青素組740Y-P組原花青素+740Y-P組牙齦指數/分0 2.02±0.17a 0.42±0.07b 2.61±0.15b 1.95±0.12cd IL-18/（pg/mL）53.15±10.36 135.42±18.17a 67.98±9.30b 218.64±40.85b 130.12±21.05cd iNOS/（U/mL）12.85±2.54 60.13±9.16a 24.79±4.39b 118.92±17.08b 57.34±7.93cd ALP/（U/L）231.27±25.08 418.39±48.43a 325.13±45.82b 562.91±66.25b 405.76±52.59cd

3.2 原花青素對牙齦炎大鼠齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素組大鼠齦溝液中上述指標均顯著降低（P＜0.05），740Y-P組則顯著升高（P＜0.05）；與原花青素組比較，原花青素+740Y-P組大鼠齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平均顯著升高（P＜0.05）；與740Y-P組比較，原花青素+740Y-P組大鼠齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表1。

3.3 原花青素對牙齦炎大鼠牙齦組織病理形態的影響

對照組大鼠牙齦組織無炎癥細胞浸潤，形態結構未見損傷；模型組大鼠牙齦組織可見嚴重的病理損傷，具體表現為局部組織擴張充血、新生毛細血管出現、膠原纖維變性丟失且排列紊亂，且齦溝壁處可見大量炎癥細胞浸潤；原花青素組大鼠牙齦組織上述病理損傷有所減輕，而740Y-P組則有所加重；原花青素+740Y-P組牙齦組織的病理損傷情況與模型組相似。結果見圖1。

圖1 各組大鼠牙齦組織病理形態觀察的顯微圖（HE染色）

3.4 原花青素對牙齦炎大鼠牙齦組織中SOD、CAT、ROS水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著降低，ROS水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，原花青素組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著升高，ROS水平顯著降低（P＜0.05）；740Y-P組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著降低，ROS水平顯著升高（P＜0.05）。與原花青素組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著降低，ROS水平顯著升高（P＜0.05）。與740Y-P組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著升高，ROS水平顯著降低（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組大鼠牙齦組織中SOD、CAT、ROS水平比較（±s，n＝12，U/mg）

表2 各組大鼠牙齦組織中SOD、CAT、ROS水平比較（±s，n＝12，U/mg）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與原花青素組比較，P＜0.05；d：與740Y-P組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組原花青素組740Y-P組原花青素+740Y-P組SOD 7.21±1.62 2.93±0.28a 6.88±0.96b 0.56±0.09b 3.01±0.44cd CAT 6.22±0.68 2.34±0.31a 5.81±0.66b 0.42±0.08b 2.25±0.34cd ROS 1.13±0.21 6.95±1.22a 1.51±0.26b 10.38±1.82b 6.88±1.04cd

3.5 原花青素對牙齦炎大鼠牙齦組織中PI3K/Akt/VEGF信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠牙齦組織中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平和VEGF蛋白的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素組大鼠牙齦組織中上述指標均顯著降低，740Y-P組則顯著升高（P＜0.05）；與原花青素組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦組織中上述指標均顯著升高（P＜0.05）；與740Y-P組比較，原花青素+740Y-P組大鼠牙齦組織中上述指標均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖2、表3。

圖2 各組大鼠牙齦組織中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、VEGF蛋白表達的電泳圖

表3 各組大鼠牙齦組織中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平和VEGF蛋白表達水平比較（±s，n＝12）

表3 各組大鼠牙齦組織中PI3K、Akt蛋白磷酸化水平和VEGF蛋白表達水平比較（±s，n＝12）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與原花青素組比較，P＜0.05；d：與740Y-P組比較，P＜0.05。

VEGF/GAPDH 0.33±0.07 0.72±0.14a 0.45±0.08b 0.85±0.16b 0.70±0.12cd組別對照組模型組原花青素組740Y-P組原花青素+740Y-P組p-PI3K/PI3K 0.51±0.10 1.44±0.25a 0.56±0.09b 2.16±0.39b 1.38±0.17cd p-Akt/Akt 0.32±0.06 0.87±0.16a 0.48±0.10b 1.25±0.22b 0.82±0.15cd

4 討論

牙齦炎是一種牙齦組織炎癥性疾病，其病變尚未深入牙周組織，波及范圍不廣，對其進行早期治療和干預可避免其發展為牙周炎，對患者口腔健康及正常咀嚼功能的維持具有積極意義。IL-18作為促炎因子可參與機體的免疫應答及炎癥進程；iNOS可催化一氧化氮產生，進而誘導氧化應激發生[13-14]。當牙齦組織發生病變時，上皮細胞會釋放出包含ALP在內的多種組織特異性酶，故ALP可作為評價牙齦病變的主要指標[15]。SOD、CAT、ROS是反映機體氧化應激程度的重要指標，氧化應激的發生常常伴隨SOD、CAT水平的下降和ROS水平的上升[11]。本研究通過絲線縫扎大鼠上頜雙側第1磨牙牙頸部并在牙齦處涂抹麥芽糖和喂食蔗糖的方法構建牙齦炎大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平顯著降低，牙齦指數、牙齦組織中ROS和齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平均顯著升高，同時伴有牙齦組織局部擴張充血、新生毛細血管出現、膠原纖維變性丟失且排列紊亂、大量炎癥細胞浸潤齦溝壁等病理損傷，表明大鼠出現了明顯的牙齦炎癥及氧化應激。

原花青素是提取自葡萄籽的一種天然黃酮類化合物，具有較強的抗炎、抗氧化活性，可阻止氧化應激及炎癥反應的發生及進展，減輕原發性高血壓大鼠的腎臟損傷，并可明顯抑制磷酸三鈣磨損顆粒誘導的骨細胞凋亡，還可改善糖尿病牙周炎大鼠的牙周組織損傷[16-17]。由此本課題組推測，原花青素對牙齦炎可能具有防治作用。為此，本研究以原花青素干預牙齦炎大鼠，結果顯示，該成分可顯著升高大鼠牙齦組織中SOD、CAT水平，顯著降低牙齦指數，齦溝液中IL-18、iNOS、ALP水平和牙齦組織中ROS水平，減輕大鼠牙齦組織的病理損傷，表明原花青素對牙齦炎大鼠具有較好的干預作用，可抑制炎癥反應和氧化應激，具有作為牙齦炎治療藥物的潛力。

PI3K/Akt信號通路作為炎癥反應及過氧化反應的重要信號調控通路，可參與牙周炎等炎癥性疾病病理進程，下調PI3K/Akt信號通路可降低炎癥因子的表達水平，抑制牙周炎癥[18]；同時有研究指出，VEGF上調引發的血管病理性新生是牙周疾病的重要病理特征[19]。由此可見，抑制PI3K/Akt/VEGF信號通路可能是治療牙齦炎的有效策略。本研究結果顯示，牙齦炎大鼠牙齦組織中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平和VEGF蛋白的表達水平均顯著升高，提示PI3K/Akt/VEGF信號通路參與了模型大鼠的牙齦損傷；經原花青素干預后，大鼠牙齦組織中上述指標均顯著降低，提示原花青素可通過下調PI3K/Akt/VEGF信號通路來抑制炎癥反應和氧化應激，減輕模型大鼠的牙齦組織損傷。本研究進一步以PI3K/Akt信號通路激活劑740Y-P干預牙齦炎大鼠進行驗證，結果顯示，740Y-P可加重大鼠的牙齦損傷，減弱原花青素對牙齦炎癥及氧化應激損傷的改善作用，逆轉原花青素對牙齦組織的保護作用，初步證實了原花青素的上述作用與抑制PI3K/Akt/VEGF信號通路有關。

綜上所述，原花青素可通過抑制PI3K/Akt/VEGF信號通路來緩解牙齦炎大鼠的牙齦組織損傷，改善牙齦炎癥和氧化應激。但考慮到本研究未設置陽性對照藥物（如甲硝唑、阿莫西林），且并未評價原花青素的量效關系，本課題組后續將進一步完善實驗設計，基于更多潛在機制，深入評價原花青素的藥效和安全性。