繡球藤提取物的抗炎活性及機制Δ

李海山 ，楊和金 ，鄭永仁 （1.云南省食品藥品審核查驗中心，昆明 650106；.云南省藥物研究所藥理室，昆明 650111；3.云南中醫藥大學動物實驗中心，昆明 650500）

繡球藤是毛茛科Ranunculaceae鐵線蓮屬Clematis植物毛茛狀鐵線蓮ClematisranunculoidesFranch.的干燥全草，主要分布于我國云南西北部、四川西南部、廣西西北部、貴州西南部和西藏喜馬拉雅地區，具有良好的藥用價值和觀賞價值[1]。該藥始載于《滇南本草》，以全草或根入藥，味苦、淡、微辛，性微寒，具有清熱解毒、利尿、祛瘀通絡的功效。然而，目前關于繡球藤的研究有限，其藥用價值并未得到充分發掘。

鐵線蓮屬植物分布廣泛，我國約有150種，包括威靈仙、東北鐵線蓮、小木通等。該屬植物的主要化學成分包括皂苷類、黃酮類、木脂素類、香豆素類和生物堿類等，其中皂苷類成分以齊墩果烷型五環三萜為主，黃酮類成分以黃酮糖苷為主[2]。目前，同屬植物威靈仙的相關研究較為多，其抗炎活性明確[3]。作為鐵線蓮屬植物的一員，本課題組推測繡球藤的藥理活性亦有相似之處。基于此，本研究從抗炎角度出發，通過二甲苯致小鼠耳腫脹實驗和大鼠棉球肉芽腫實驗評價繡球藤對急、慢性炎癥的抑制活性，并探討繡球藤對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥反應的改善作用及可能機制，挖掘其藥用價值，為繡球藤的進一步開發提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有CCL-170A-8型CO2恒溫培養箱（新加坡ESCO公司），LSM900型激光共聚焦顯微鏡、Axio Observer 3型熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司），Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），Mini-Protean小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot?轉印系統（美國Bio-Rad公司），WD-9423B型化學發光分析儀（北京六一生物科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

繡球藤藥材采自云南省大理、麗江等地，經云南中醫藥大學中藥學院張潔教授鑒定為毛茛科鐵線蓮屬植物毛茛狀鐵線蓮C.ranunculoidesFranch.的全草。

阿司匹林腸溶片（批號BJ71068，規格100 mg）購自意大利Bayer S.p.A.；LPS、二甲基亞砜（DMSO）、MTT試劑（批號分別為059M4031V、WXBB8079V、2031162）均購自美國Sigma公司；二甲苯（批號220111）購自四川西隴科學有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、DMEM培養基、胎牛血清（批號分別為2436350、2522571、1997802c）均購自美國Gibco公司；RIPA裂解液、特超敏ECL化學發光試劑盒（批號分別為072021211125、P0018AM）均購自上海碧云天生物技術股份有限公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號均為2210-1）均購自深圳市達科為生物技術股份有限公司；前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA試劑盒（批號J17011754）購自武漢華美生物工程有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號20221121）購自南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號22343569）購自北京蘭杰柯科技有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、β-肌動蛋白（β-actin）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、p65、磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）單克隆抗體（批號分別為5174S、4970S、13120S、8242T、3033T）均購自美國CST公司；兔源環氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（批號分別為100022L-13、GR3366929-3）均購自英國Abcam公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記的山羊抗兔IgG二抗（批號BJ07284902）購自北京博奧森生物技術有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）試劑（批號20210830）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性昆明小鼠（體重18～20 g，共60只）和SPF級雄性SD大鼠（體重180～220 g，共50只）均購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號均為SCXK（京）2019-0010。上述動物均在SPF級環境（溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，每12 h明暗交替）下飼養，自由飲水、進食。本研究所涉及的實驗操作均符合云南中醫藥大學實驗動物倫理規定，并經過該校動物實驗倫理審查委員會批準（編號R-062023071）。

1.4 細胞株

小鼠巨噬細胞RAW264.7購自中國科學院細胞庫。

2 方法

2.1 繡球藤提取物的制備

取繡球藤藥材適量，粉碎，加10倍量水，提取1.5 h×2次，合并提取液，抽濾，減壓濃縮后，冷凍干燥，得繡球藤提取物粉末（得率15.8%）。經紫外分光光度法測定（平行3次），其中含總皂苷（24.57±0.70）%、總黃酮（1.53±0.10）%。

2.2 繡球藤提取物對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響檢測

取昆明小鼠，按體重隨機分為對照組、阿司匹林組（陽性對照，0.25 g/kg，以0.5%羧甲基纖維素納為溶劑）和繡球藤提取物低、中、高劑量組（1.25、2.5、5 g/kg，以水為溶劑），每組12只。其中，繡球藤提取物中劑量相當于其半數致死劑量（median lethal dose，LD50）的1/10，阿司匹林劑量相當于臨床等效劑量。各藥物組小鼠灌胃相應藥液，空白對照組小鼠灌胃水，灌胃體積均為20 mL/kg，連續7 d，每天1次。于末次給藥后1 h，除對照組外，其余各組小鼠均將致炎劑二甲苯均勻涂布于其右耳廓（50 μL/只）；致炎1 h后，各組小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器分別在同一部位打孔，稱定耳片質量并按下式計算耳腫脹度：耳腫脹度（mg）＝造模致炎耳（右耳）耳片質量－自身對照耳（左耳）耳片質量。

2.3 繡球藤提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響檢測

取SD大鼠，按體重隨機分為對照組、阿司匹林組（藥性對照，0.17 g/kg，以0.5%羧甲基纖維素納為溶劑）和繡球藤提取物低、中、高劑量組（0.88、1.75、3.5 g/kg，以水為溶劑），每組10只。其中，繡球藤提取物中劑量相當于其LD50的1/10，阿司匹林劑量相當于臨床等效劑量。各組大鼠經麻醉后，去除背部毛發，消毒后切口，將經滅菌處理的2個棉球（每個棉球加入1 mg/mL的青霉素鈉溶液0.1 mL，于60 ℃下烤干，烘干后重約75 mg）分別植入其兩側腋窩皮下。隨后，各藥物組大鼠灌胃相應藥液，對照組大鼠灌胃水，灌胃體積均為10 mL/kg，連續7 d，每天1次。末次給藥后1 h，各組大鼠脫頸椎處死，取出棉球，于60 ℃下烘干6 h后稱重并按下式計算肉芽凈重：肉芽凈重（mg）＝末次給藥后的棉球質量－原棉球質量。

2.4 繡球藤提取物對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥損傷的改善作用及機制考察

2.4.1 細胞毒性檢測

取RAW264.7細胞，接種于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，常規復蘇、傳代后，于37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養。取對數生長期細胞，以2×105個/mL、每孔0.1 mL接種于96孔板中，待細胞貼壁融合后，棄去上清液；將細胞分為正常對照組和繡球藤提取物不同質量濃度組（12.5、25、50、100、200 μg/mL，根據本課題預實驗結果設置），每組設10個復孔。正常對照組細胞加入無血清DMEM培養基，各藥物組細胞加入含相應質量濃度藥物的無血清DMEM培養基。培養24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL；孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入DMSO 150 μL；振蕩10 min后，使用酶標儀于490 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，用以反映繡球藤提取物的細胞毒性。

2.4.2 細胞上清液中的NO、PGE2、TNF-α、IL-6、MCP-1含量檢測

取對數生長期細胞，以2×105個/mL、每孔2 mL接種于6孔板中，待細胞貼壁融合后，棄去上清液；將細胞分為正常對照組、LPS組（200 ng/mL）和繡球藤提取物不同質量濃度組（12.5、25、50 μg/mL，根據“2.4.1”項下結果設置），每組設3個復孔。正常對照組細胞加入無血清DMEM培養基，LPS組加入含200 ng/mL LPS的無血清DMEM培養基，各藥物組加入含相應質量濃度藥物和200 ng/mL LPS的無血清DMEM培養基。培養24 h后，收集細胞上清液，根據相應試劑盒說明書方法操作，使用酶標儀檢測各組細胞上清液中的NO、PGE2、TNF-α、IL-6、MCP-1含量。

2.4.3 細胞中iNOS、COX-2、p65、p-p65蛋白表達檢測

采用Western blot法檢測。取對數生長期細胞，以2×105個/mL、每孔2 mL接種于6孔板中，iNOS和COX-2的檢測按照“2.4.2”項下方法分組、處理；p65和p-p65的檢測按照“2.4.2”項下方法分組，正常對照組細胞加入無血清DMEM培養基干預7 h，LPS組細胞先用無血清DMEM培養基干預6 h后再加入200 ng/mL LPS繼續干預1 h，各藥物組細胞先用含相應質量濃度藥物的無血清DMEM培養基干預6 h后再加入200 ng/mL LPS繼續干預1 h。收集各組細胞，以RIPA裂解液于冰上裂解，于4 ℃下以14 000×g離心6 min，取上清液，采用BCA法測定蛋白含量，并加入適量蛋白上樣緩沖液，于95 ℃金屬浴中變性。取變性蛋白適量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，以5%脫脂奶粉封閉1 h；以TBST漂洗液洗膜，加入iNOS、COX-2、GAPDH和p65、p-p65、β-actin一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；以TBST漂洗液洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的IgG二抗（稀釋比例為1∶3 000），室溫下孵育1 h；以TBST漂洗液洗膜，以特超敏ECL化學發光試劑顯影后置于化學發光分析儀下曝光拍照。使用Image J軟件，對各目的蛋白的條帶灰度值進行分析：以GAPDH為內參，計算iNOS、COX-2蛋白的相對表達量；以β-actin為內參，計算p65、p-p65的相對表達量，并記錄兩者比值（p-p65/p65）。

2.4.4 細胞內p65蛋白核轉移檢測

采用免疫熒光法檢測。取對數生長期細胞，以1×105個/mL、每皿2 mL接種于共聚焦小皿中。待細胞貼壁融合后，去除上清液，將其分為正常對照組、LPS組（200 ng/mL）和繡球藤提取物25、50 μg/mL組，每組設3個平行皿。正常對照組細胞加入無血清DMEM培養基干預9 h，LPS組細胞先用無血清DMEM培養基干預6 h后再加入200 ng/mL LPS繼續干預3 h，各藥物組先用含相應質量濃度藥物的無血清DMEM培養基干預6 h后再加入200 ng/mL LPS繼續干預3 h。收集各組細胞，以PBS漂洗，于室溫下在4%多聚甲醛中固定10 min；再用PBS漂洗后，以山羊血清于37 ℃下封閉1 h；吸干，滴加p65一抗（稀釋比例為1∶400），4 ℃下避光孵育過夜；用PBS漂洗后，加入FITC標記的IgG二抗（稀釋比例為1∶50），37 ℃下避光孵育1 h；以PBS漂洗，加入DAPI試劑避光孵育2 min；再用PBS漂洗后，滴加防熒光淬滅劑，使用激光共聚焦顯微鏡觀察p65蛋白的核轉移情況（p65蛋白呈綠色熒光，細胞核呈藍色熒光）。

2.5 統計學方法

采用SPSS 22軟件對數據進行統計分析。數據以±s表示，多組間比較應用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett’sT3檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 繡球藤提取物對小鼠耳廓腫脹的影響

與對照組比較，阿司匹林組和繡球藤提取物高劑量組小鼠的耳腫脹度均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

表1 繡球藤提取物對小鼠耳廓腫脹和大鼠肉芽腫的影響（±s）

表1 繡球藤提取物對小鼠耳廓腫脹和大鼠肉芽腫的影響（±s）

a：與對照組比較，P＜0.01；b：與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組阿司匹林組繡球藤提取物低劑量組繡球藤提取物中劑量組繡球藤提取物高劑量組大鼠肉芽凈重（n＝10）/mg 28.0±8.6 17.2±6.9a 24.9±5.2 20.4±5.4b 21.7±2.8b小鼠耳廓腫脹度（n＝12）/mg 17.4±4.4 11.3±4.5a 18.8±5.2 14.0±4.6 13.1±4.2b

3.2 繡球藤提取物對大鼠肉芽腫的影響

與對照組比較，阿司匹林組和繡球藤提取物中、高劑量組大鼠的肉芽凈重均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見表1。

3.3 繡球藤提取物對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥損傷的影響

3.3.1 繡球藤提取物的細胞毒性

繡球藤提取物12.5、25、50 μg/mL組細胞的OD值（2.79±0.12、2.74±0.11、2.76±0.10）與正常對照組（2.78±0.11）比較，差異均無統計學意義（P＞0.05，n＝10），而繡球藤提取物100、200 μg/mL組細胞的OD值（2.32±0.12、1.80±0.14）均較正常對照組顯著降低（P＜0.01，n＝10）。因此，本研究后續實驗采用12.5、25、50 μg/mL作為繡球藤提取物的干預濃度。

3.3.2 繡球藤提取物對細胞上清液中NO、PGE2、TNFα、IL-6、MCP-1含量的影響

與正常對照組比較，LPS組細胞上清液中NO、PGE2、TNF-α、IL-6、MCP-1含量均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，繡球藤提取物25、50 μg/mL組細胞上清液中NO含量和繡球藤提取物各質量濃度組細胞上清液中PGE2、TNF-α、IL-6、MCP-1含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且有一定的濃度依賴趨勢。結果見表2。

表2 繡球藤提取物對細胞上清液中NO、PGE2、TNFα、IL-6、MCP-1含量的影響（±s，n＝3）

表2 繡球藤提取物對細胞上清液中NO、PGE2、TNFα、IL-6、MCP-1含量的影響（±s，n＝3）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與LPS組比較，P＜0.01；c：與LPS組比較，P＜0.05。

組別正常對照組LPS組繡球藤提取物12.5 μg/mL組繡球藤提取物25 μg/mL組繡球藤提取物50 μg/mL組NO/（μmol/L）1.64±0.68 15.25±1.13a 15.17±1.31 PGE2/（pg/mL）128.79±8.97 633.52±30.18a 501.85±32.54b TNF-α/（pg/mL）382.03±9.32 3 041.56±184.24a 2 140.96±262.14b IL-6/（pg/mL）23.35±2.12 209.45±7.14a 162.54±2.93b MCP-1/（pg/mL）784.44±85.61 1 639.15±121.34a 1 451.14±77.09c 11.91±0.79b 368.71±34.99b 1 640.46±64.23b 124.07±5.44b 1 098.95±37.66b 6.27±0.79b 260.60±54.96b 1 148.61±86.81b 102.88±11.96b 961.18±56.76b

3.3.3 繡球藤提取物對細胞中iNOS、COX-2、p65、p-p65蛋白表達的影響

與正常對照組比較，LPS組細胞中iNOS、COX-2蛋白的相對表達量和p-p65/p65均顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，繡球藤提取物各質量濃度組細胞中iNOS、COX-2蛋白的相對表達量和p-p65/p65均顯著降低（P＜0.01）；而p65蛋白的相對表達量組間比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1、圖2。

圖1 繡球藤提取物對細胞中iNOS、COX-2、p65、p-p65蛋白表達影響的電泳圖

圖2 繡球藤提取物對細胞中iNOS、COX-2、p65、p-p65蛋白表達的影響（±s，n＝3）

3.3.4 繡球藤提取物對細胞內p65蛋白核轉移的影響

正常對照組細胞中p65蛋白未與細胞核重疊；與正常對照組比較，LPS組細胞中p65蛋白與細胞核重疊；與LPS組比較，繡球藤提取物25、50 μg/mL組細胞中p65蛋白與細胞核部分重疊。結果見圖3。

圖3 繡球藤提取物對細胞內p65蛋白核轉移的影響（標尺為10 μm）

4 討論

炎癥反應是機體通過不同免疫細胞（如巨噬細胞）針對有害刺激所產生的一種協調、主動性應激和防御反應，對病原體清除及組織修復至關重要，但免疫穩態失衡和炎癥介質持續釋放會導致慢性炎癥的發生[4]。現代研究發現，炎癥與疼痛、惡性腫瘤、動脈粥樣硬化、代謝性疾病等多種疾病的發生、發展息息相關[5-6]。二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗和大鼠棉球肉芽腫實驗是評價急性炎癥和慢性炎癥的經典動物模型，具有操作簡單、便于觀察的優點，是評價藥物抗炎活性的常用動物模型。本研究結果顯示，高劑量的繡球藤提取物（5 g/kg）可顯著降低小鼠耳腫脹度，提示其對二甲苯所引起的急性炎癥具有抑制作用；同時，中、高劑量的繡球藤提取物（1.75、3.5 g/kg）可顯著降低大鼠的肉芽凈重，提示其對異物刺激所導致的慢性炎癥亦有抑制作用。

LPS誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7炎癥損傷模型是研究抗炎作用機制的首選模型[7]。研究指出，巨噬細胞是機體炎癥反應的主要參與者，而LPS作為構成革蘭氏陰性菌外壁的內毒素，可促進炎癥反應的發生[8]。核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是經典的炎癥信號通路[9]。一般情況下，NF-κB以p50/p65二聚體形式存在于細胞質中；當受到LPS刺激時，NF-κB信號通路被激活，其中p65蛋白亞基發生磷酸化并由細胞質轉移至細胞核內[10]，激活下游相關基因的轉錄，進而促進炎癥介質和趨化因子（包括TNF-α、IL-6、MCP-1、iNOS、COX-2）的大量產生，最終引發炎癥反應[11]。其中，iNOS和COX-2屬于炎癥反應的關鍵誘導酶[12-13]，iNOS的過量表達能快速誘導NO的生成；而COX-2是合成PGE2的限速酶，其表達增加可促進PGE2的產生，從而進一步加速炎癥級聯反應[14]。本研究結果顯示，繡球藤提取物可顯著抑制巨噬細胞的炎癥反應，包括抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放，抑制趨化因子MCP-1的產生；還可抑制iNOS、COX-2蛋白的表達，進而阻斷NO和PGE2的合成；同時，其對p65蛋白的表達無明顯影響，但可抑制p65蛋白的磷酸化及其從細胞質向細胞核的轉移，因此推測繡球藤提取物抑制巨噬細胞的炎癥反應與其阻斷NF-κB信號通路的激活有關。

綜上所述，繡球藤提取物具有良好的抗炎活性，其作用機制可能與抑制NF-κB信號通路激活、下調COX-2和iNOS蛋白的表達、減少炎癥因子的釋放有關。本研究從炎癥角度初步探索了繡球藤提取物的藥理活性，但未就某一具體炎癥性疾病展開研究，后續將結合具體模型進一步挖掘繡球藤的臨床應用價值。