氨磷汀通過調節腸道菌群對急性輻射損傷的防護作用機制Δ

叢悅，李莉，趙藝萌，徐媛媛，拱健婷，關佳莉（首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫藥研究所，北京 100010）

X射線是一種具有極短波長的電磁輻射，已被廣泛用于醫學成像診斷和腫瘤治療中。然而X射線的電離輻射會對患者的正常組織產生巨大持久的損傷，引發放射性口腔炎、放射性肺炎、放射性直腸炎等副反應，極大地影響患者的生存質量，因此輻射前后及時給予輻射防護藥物是減輕患者正常組織輻射損傷的必要措施。

氨磷汀是目前已知防護效果最好的輻射防護劑，對造血系統和胃腸輻射損傷防護的劑量降低系數分別為2.7和1.8[1]，并已作為細胞保護劑被美國FDA批準用于減輕卵巢癌或肺癌患者使用順鉑后引起的腎臟毒性和頭頸癌患者放療導致的口干癥[2]。已有研究證實，氨磷汀經轉化后可形成活性物質WR-1065及WR-33278，其輻射防護機制主要是清除射線產生的氧自由基，增強DNA保護和修復功能，消耗細胞內氧分子[3]。

人體腸道微生物菌群可以影響宿主發育、代謝、免疫等多方面生理功能，微生物菌群穩態平衡與腸炎、肥胖、神經系統疾病等密切相關[4]。腸道微生物還可以影響宿主對電離輻射的敏感性和病理反應，大劑量急性輻射損傷和低劑量慢性輻射損傷時均可見腸道菌群組成發生明顯變化[5]。同時，電離輻射亦會導致腸道菌群的衍生物發生改變，而這些衍生物往往參與了輻射損傷引起的多種細胞功能的調節[6]。因此，調節腸道微生態平衡有望成為一種新的減輕機體輻射損傷的治療策略。本研究擬采用16S rRNA擴增子測序技術探究氨磷汀對急性輻射損傷小鼠腸道菌群的影響，從腸道微生物菌群調節角度研究氨磷汀的輻射防護作用機制。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括NanodropTM2000型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）、QuantiFluorTM-ST微型熒光計（美國Promega公司）、GeneAMP? 9700型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國ABI公司）、BC-2800vet型獸用全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞動物醫療科技股份有限公司）、RS2000 Pro225型生物學X射線輻照儀（美國Rad Source公司）。

1.2 主要藥品與試劑

氨磷汀對照品（批號A6493，純度98%）購自上海士鋒生物科技有限公司；TIANamp Stool DNA Kit試劑盒（批號DP328）購自天根生化科技（北京）有限公司；Phusion高保真DNA聚合酶（批號F630L）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（批號AP-GX-50）購自美國Axygen公司；Nextera XT DNA Sample Preparation Kit 建庫試劑盒（批號FC-131-1024）購自美國Illumina公司。

1.3 動物

SPF級C57BL/6J小鼠30只，雄性，體重（20±2）g，購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號SCXK（鄂）2020-0018。小鼠在SPF環境中飼養，室溫20～26 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替12 h；所有動物均自由食用滅菌飼料、飲用滅菌水。本實驗方案經首都醫科大學附屬北京中醫醫院實驗動物福利倫理委員會批準（批準文號BJTCM-M-2022-10-02）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將30只小鼠在SPF環境中適應性喂養7 d后，于照射前24 h稱重并隨機分為正常對照組、模型組和氨磷汀組，每組10只。氨磷汀組小鼠腹腔注射氨磷汀150 mg/kg（參考前期氨磷汀的毒理研究和輻射防護效果、臨床應用劑量等因素，選擇毒性反應較低的劑量），正常對照組和模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。給藥30 min后，將模型組和氨磷汀組小鼠置于生物學X射線輻照儀中進行一次性全身照射，照射劑量4 Gy，照射劑量率1 Gy/min，輻照距離180 mm。照射后盡快將小鼠送回SPF環境中。

2.2 一般情況觀察和外周血象檢測

觀察并記錄小鼠照射后14 d內的死亡情況。各組小鼠分別于照射前2 h和照射后第1、4、7、10、14天取血10 μL，加獸用全自動血液細胞分析儀稀釋液10 μL后，檢測小鼠外周血中白細胞、血小板和紅細胞計數，分析照射后第7天各類白細胞（中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞）的比例變化。

2.3 小鼠糞便標本采集和腸道菌群基因測序

照射后第7天，采用應激性排便法收集每組3只小鼠的新鮮糞便，并置于滅菌凍存管中，－80 ℃保存、備用。采用DNA Kit試劑盒提取糞便樣本的總DNA，用超微量分光光度計測定DNA濃度和純度，對提取所得細菌DNA的16SrRNA基因V3～V4區進行PCR擴增。擴增引物序列為：正向引物5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，反向引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′；產物大小為465 bp。利用含2%溴化乙錠的瓊脂糖進行凝膠電泳檢驗PCR擴增產物，用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收DNA產物并純化，產物使用QuantiFluorTM-ST微型熒光計進行DNA定量測定。使用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit建庫試劑盒構建測序文庫并經質檢后，用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對文庫進行PE250雙端測序。原始序列數據經質控、去噪、拼接、去嵌合等處理后進行DADA2方法聚類，默認以100%相似度將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。根據聚類結果對OTUs進行單樣本的多樣性分析（α多樣性分析）和基于UniFrac算法的各組樣本之間的多樣性分析[β多樣性分析，利用主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）顯示樣本微生物組模式]。根據分類學信息，在各分類水平上完成群落結構的統計分析，利用線性判別分析法（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析在豐度上有顯著差異的物種。

2.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。外周血象檢測數據用單因素方差分析比較組間差異，存在組間差異的時間點采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。檢驗水準α＝0.05。采用R語言繪制小鼠腸道菌群在門、屬分類水平的群落結構熱圖。采用Pearson檢驗進行相關性分析。

3 結果

3.1 氨磷汀對小鼠外周血象的影響

各組小鼠經4 Gy X射線全身照射后，14 d內無死亡。與正常對照組小鼠比較，模型組和氨磷汀組小鼠外周血中白細胞計數在X射線照射后第1天急劇下降至最低，第4天時逐漸恢復；氨磷汀組在照射后第1、4、7、10天均顯著高于模型組（P＜0.05或P＜0.01，圖1A）。模型組和氨磷汀組小鼠照射后血小板計數均先下降，并于第10天降至最低，但氨磷汀組顯著高于模型組（P＜0.05）；隨后兩組小鼠血小板數逐漸升高（圖1B）。模型組小鼠紅細胞計數從照射后第1天開始逐步下降，而氨磷汀組則在照射后第1天輕微升高，且顯著高于模型組（P＜0.05），隨后逐漸降低；模型組和氨磷汀組小鼠紅細胞計數在14 d觀察期內未見恢復（圖1C）。

圖1 各組小鼠外周血象變化（n＝10）

3.2 氨磷汀對小鼠腸道菌群的影響

3.2.1 各組小鼠高通量測序數據統計及α/β多樣性分析經高通量測序分析，3組樣本共獲得有效序列25 764～379 035條，采用稀疏方法對每組樣本測序數據量進行抽平，抽平后數據量為25 735條序列。對所有抽平后數據進行OTUs聚類，共獲得15個門、24個綱、42個目、97個科、209個屬、386個種的菌群信息。3組共有OTUs 1 629個，正常對照組、模型組和氨磷汀組獨有的OTUs分別為320、283、366個（圖2A）。α多樣性可反映樣品內微生物菌群的豐度和多樣性，本研究分別用Chao1指數和Shannon指數表征豐度和多樣性。X射線照射后第7天，正常對照組、模型組和氨磷汀組小鼠腸道菌群豐度和多樣性無顯著差異（圖2B、C）。β多樣性能反映不同組間的菌群多樣性，主要用于比較樣本的組間差異。PCoA結果顯示，正常對照組和模型組分離良好，PCoA1軸解釋度為22.4%，PCoA2軸解釋度為17.0%（圖2D）。與正常對照組比較，模型組小鼠腸道微生物結構發生了明顯變化，說明輻射顯著改變了小鼠的腸道微生物結構。氨磷汀組也與模型組產生分離，說明氨磷汀能改變輻射引起的腸道菌群結構改變。

圖2 各組小鼠腸道菌群OTUs數量及α/β多樣性分析結果（n＝3）

3.2.2 不同水平的腸道菌群物種組成分析

在門水平上，擬桿菌門Bacteroidetes、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinobacteria和變形菌門Proteobacteria是優勢菌門。與正常對照組比較，模型組擬桿菌門Bacteroidetes相對豐度降低，厚壁菌門Firmicutes相對豐度增加，擬桿菌門Bacteroidetes與厚壁菌門Firmicutes相對豐度（B/F）比值降低。與模型組比較，氨磷汀組擬桿菌門Bacteroidetes相對豐度增加，厚壁菌門Firmicutes相對豐度降低，B/F比值增加，且二者相對豐度與正常對照組相對豐度接近（圖3A）。

圖3 各組小鼠腸道菌群在門和屬水平的物種組成分布

在屬水平上，正常對照組占比最高的5種菌屬分別為巴恩斯氏菌屬Barnesiella（27.74%）、鏈球菌屬Streptococcus（12.61%）、普雷沃菌屬Prevotella（5.42%）、韋榮氏球菌屬Veillonella（4.97%）和乳桿菌屬Lactobacillus（2.52%）；模型組分別為巴恩斯氏菌屬Barnesiella（30.41%）、鏈球菌屬Streptococcus（11.86%）、異芽孢桿菌屬Allobaculum（8.14%）、韋榮氏球菌屬Veillonella（3.99%）和普雷沃菌屬Prevotella（1.77%）；氨磷汀組分別為巴恩斯氏菌屬Barnesiella（40.49%）、乳桿菌屬Lactobacillus（7.25%）、鏈球菌屬Streptococcus（4.57%）、異芽孢桿菌屬Allobaculum（3.46%）和韋榮氏球菌屬Veillonella（1.83%）（圖3B）。

3.2.3 組間群落差異性分析

LEfSe結果顯示，模型組有異芽孢桿菌屬Allobaculum、丹毒絲菌綱Erysipelotrichia、丹毒絲菌目Erysipelotrichales和丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae 4個差異性物種，氨磷汀組有小鼠乳桿菌Lactobacillusmurinus和卷曲乳桿菌L.crispatus2個差異性物種（圖4）。

圖4 各組小鼠腸道菌群LEfSe分析

3.3 腸道菌群變化與各類白細胞比例的相關性分析

與正常對照組比較，模型組小鼠淋巴細胞比例顯著降低，單核細胞比例顯著升高（P＜0.05，圖5A、B）。與模型組比較，氨磷汀組小鼠淋巴細胞比例顯著升高，單核細胞比例顯著降低（P＜0.05，圖5A、B）。3組小鼠中性粒細胞比例比較，差異均無統計學意義（P＞0.05，圖5C）。

圖5 各組小鼠腸道菌群豐度與各類白細胞比例相關性分析結果（n＝3）

在LEfSe基礎上，將篩選出的6個差異性物種與各類白細胞進行Pearson相關性分析。小鼠乳桿菌L.murinus和卷曲乳桿菌L.crispatus的豐度與中性粒細胞比例呈顯著負相關（P＜0.05）；異芽孢桿菌屬Allobaculum、丹毒絲菌綱Erysipelotrichia、丹毒絲菌目Erysipelotrichales和丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae的豐度與淋巴細胞比例均呈顯著負相關（P＜0.01）；6個差異性物種與單核細胞比例無明顯相關性（P＞0.05）。結果見圖5D。

4 討論

正常情況下，腸道內的微生物可在腸道發揮共生功能，腸道菌群和腸道屏障之間處于穩態平衡。研究顯示，輻射會破壞腸道屏障，使致病菌過度繁殖，釋放大量內源性毒素，引起炎癥反應，如盆腔或腹部放療可導致約50%的患者發生胃腸道黏膜炎，而氨磷汀可使放療所致胃腸道黏膜炎的發生風險降低50%～70%[7]。為探討氨磷汀對機體的輻射損傷保護機制是否與腸道菌群變化相關，本研究采用16S rRNA擴增子測序技術探討了氨磷汀對急性輻射損傷小鼠腸道菌群的影響。結果顯示，X射線照射后第7天，正常對照組、模型組和氨磷汀組小鼠腸道菌群豐度和多樣性均無顯著差異，與Zheng等[8]研究結果一致。但Zhao等[9]對不同劑量γ射線照射小鼠腸道菌群的多樣性分析顯示，照射后6 h和3.5 d時，不同照射劑量組小鼠腸道菌群的α多樣性無顯著差異；照射后7 d時，4 Gy和8 Gy輻射組的Chao1指數和Shannon指數較對照組顯著下降。本研究中各組小鼠腸道菌群α多樣性無顯著變化可能與動物品系、射線類型及照射劑量等因素相關。

擬桿菌門Bacteroidetes在宿主腸道中起著益生菌的作用，該門下多種細菌能產生短鏈脂肪酸，如丁酸鹽、戊酸等，有助于減少炎癥反應和維持腸道健康。B/F比值的降低能在一定程度上反映腸道微生物菌群失調和腸道損傷的典型特征[10]。Li等[11]對小鼠放射性腸炎模型進行測序發現，局部照射可導致B/F比值下降，鼠乳酸菌屬豐度降低。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腸道內B/F比值降低，與文獻報道結果[11]一致。LEfSe結果顯示，模型組有異芽孢桿菌屬Allobaculum、丹毒絲菌綱Erysipelotrichia、丹毒絲菌目Erysipelotrichales和丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae 4個差異性物種。異芽孢桿菌屬Allobaculum是丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae的下屬分級，丹毒絲菌綱Erysipelotrichia及其下屬分級屬于厚壁菌門Firmicutes。已有研究顯示，丹毒絲菌科與炎癥相關，如Dinh等[12]在對慢性人類免疫缺陷病毒感染患者的腸道菌群研究中發現，丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae的相對豐度與腫瘤壞死因子α水平呈正相關；Schaubeck等[13]在小鼠克隆氏腸炎模型中發現，丹毒絲菌科Erysipelotrichaceae相對豐度顯著升高。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腸道菌群紊亂，與炎癥相關的菌群顯著增多；氨磷汀干預后，小鼠腸道B/F比值增加，與模型組比較，氨磷汀組小鼠乳桿菌屬Lactobacillus相對豐度升高，條件致病菌屬如鏈球菌屬Streptococcus、韋榮氏球菌屬Veillonella相對豐度均降低。乳酸桿菌定植于胃腸道，可以提高營養物質的消化吸收，促進腸上皮細胞的再生，抑制腸道內腐敗菌、致病菌的繁殖，被公認為是一種益生菌[14]。上述結果表明，氨磷汀可改善輻射引起的腸道條件致病菌和益生菌比例失調。

機體造血系統受到輻射損傷后，由于各類細胞對輻射敏感性不同，白細胞最早出現數量減少，隨后血小板和紅細胞減少。白細胞數量減少的程度和最低值出現時間與損傷程度密切相關，白細胞數量最低值越低并且出現越早，表明損傷程度越重[15]。本研究結果顯示，氨磷汀可減緩小鼠輻射后全血細胞的減少，有效促進照射后14 d內白細胞計數和血小板計數的盡快恢復。腸道微生物菌群可通過促進造血細胞增殖、減少細胞死亡等機制發揮輻射保護作用，如Cui等[16]研究發現，6.5 Gy全身照射小鼠進行糞便微生物菌群移植后外周血白細胞計數有所升高，造血損傷減輕。因此，本研究進一步將組間菌群差異性物種豐度與各類白細胞比例進行相關性分析，結果顯示，模型組差異性物種豐度與淋巴細胞比例呈顯著負相關，氨磷汀組差異性物種豐度與中性粒細胞比例呈顯著負相關。以上結果提示，氨磷汀可通過抑制致炎腸道菌群、增加益生菌群，來減緩輻射導致的白細胞急劇下降。

綜上所述，氨磷汀可通過維持腸道微生物菌群平衡來減輕輻射造成的急性損傷。