高糖條件下氧化應激-AMPK-Cx43-NLRP3途徑調(diào)節(jié)大鼠胃平滑肌細胞外基質重構的機制研究*

張高源， 宋佰慧， 包伊特格樂， 張默函△

（1延邊大學醫(yī)學院組織胚胎學教研室，吉林 延吉 133000；2長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 長春 130031）

胃動力來源于平滑肌細胞的協(xié)同收縮運動，而細胞間的相互關系對平滑肌運動的影響是不可忽視的。正常狀態(tài)下胃平滑肌細胞外表面環(huán)繞著細胞外基質（extracellular matrix， ECM），具有機械連接、限制肌細胞過度伸展及影響細胞間信息傳遞的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis， DGP）大鼠胃平滑肌自主收縮運動振幅下降、頻率變慢，且存在ECM 重構[1］，表明高糖（high glucose， HG）通過誘導ECM重構降低了胃平滑肌的自主收縮功能。

縫隙連接蛋白43（connexin 43， Cx43）是最常見的縫隙連接蛋白，通常形成縫隙連接通道、半通道或以蛋白單體形式存在，在細胞增殖、凋亡和炎癥中起重要作用。Sun 等[2］研究發(fā)現(xiàn)，HG 條件下Cx43 過表達能夠抑制NRK-52E 細胞ECM 中纖連蛋白（fibronectin）、I型膠原（collagen type I， Col I）和Col IV 的表達，而Cx43 缺乏則具有相反的效果。另外，Huang等[3］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠巨噬細胞內(nèi)氧化應激狀態(tài)通過Cx43調(diào)節(jié)促進核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3）活化，且Cx43 表達增加，NLRP3 表達增加，反之Cx43 表達減弱，NLRP3 表達下降。這表明在細胞中Cx43 的異常表達可能通過NLRP3 參與調(diào)控細胞ECM 改變。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase， AMPK）廣泛存在于機體各種組織，其活性表現(xiàn)為磷酸化AMPK。前期研究發(fā)現(xiàn)，HG 通過氧化應激誘導AMPK 活性的改變[4］。Li 等[5］發(fā)現(xiàn)，HG 條件下心肌細胞Cx43 蛋白表達降低，給予apelin 后可逆轉；而沉默AMPKα可消除apelin 對Cx43 的作用。而Chen 等[6］發(fā)現(xiàn)，apelin-13能夠通過激活AMPK 抑制血管緊張素II 以濃度依賴性方式降低Cx43在HL-1細胞中的表達。這表明HG條件下AMPK 能夠調(diào)控Cx43 的表達且作用明顯。AMPK還參與ECM的分泌和重塑的調(diào)控。Wang等[7］發(fā)現(xiàn)，AMPK 活化能夠顯著減輕轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）介導的腎缺血再灌注損傷的腎小管間質纖維化。而Cho 等[8］發(fā)現(xiàn)，活化的AMPK 能夠緩解糖尿病小鼠中TGF-β 誘導的神經(jīng)纖維ECM 變化。因此，本研究以體外培養(yǎng)的原代大鼠胃平滑肌細胞為研究對象，探討氧化應激-AMPK-Cx43 參與調(diào)節(jié)ECM 重構的相關機制，旨在進一步闡明DGP 的發(fā)病機理，為防治DGP 及糖尿病其它平滑肌病變的藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細胞

大鼠原代胃平滑肌細胞購于iCell。

2 主要試劑

Col III 抗體（BOSTER）；Col I 抗體（Bioss）；Cx43抗體（Cell Signaling Technology）；NLRP3、基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2， MMP-2）、p-AMPK、嘌呤能P2X7 受體（purinergic P2X7 receptor， P2X7R）和TGF-β1 抗體（Abcam）；caspase-1 和TGF-β3 抗體（ABclonal）；金屬蛋白酶組織抑制物1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1， TIMP-1）抗體（Santa Cruz）；β-actin 抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（或羊抗鼠）IgG Ⅱ抗（Sigma）；抗氧化劑α-硫辛酸（α-lipoic acid， α-LA； STADA Pharmaceutical）；NLRP3 抑制劑MCC950、AMPK 抑制劑Compound C （CC）和Cx43 半通道阻滯劑GAP19（MedChemExpress）；大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β， IL-1β）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；Col I 和Col III ELISA 試劑盒（Merck）；大鼠腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP） ELISA試劑盒（江蘇晶美生物科技有限公司）。

3 實驗方法

3.1 細胞分組 將細胞分為正常糖（normal glucose， NG）組、HG 組、HG+MCC950（15 nmol/L）組、HG+GAP19（100 μmol/L）組、HG+CC（10 μmol/L）組和HG+α-LA（100 μmol/L）組。HG 組葡萄糖濃度35 mmol/L，檢測時間均為48 h。

3.2 細胞復蘇與傳代 取出凍存的大鼠原代胃平滑肌細胞株，37 ℃融化。將細胞懸液吸到離心管中，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液。沉淀加1 mL 培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10 min，棄上清液，加適當培養(yǎng)液后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞狀態(tài)。將瓶內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，加入5 mL PBS 清洗細胞1 次，吸出PBS 加入1.5 mL 胰酶，1 min后吸出胰酶37 ℃消化。用新鮮培養(yǎng)液混勻細胞，轉移到培養(yǎng)瓶內(nèi)添加適量新鮮培養(yǎng)液，分裝到2～3 個培養(yǎng)瓶中，每個培養(yǎng)瓶補充適量培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。調(diào)整細胞密度為1×109L-1后進行后續(xù)檢測。

3.3 Western blot 檢測細胞中蛋白表達 提取各組細胞總蛋白、膜蛋白和胞漿蛋白，全波長分光光度計測定蛋白樣品濃度。8%或12% SDS-PAGE 分離蛋白后轉膜，5%脫脂奶粉TBST 緩沖液封閉后洗膜。HG+MCC950組Ⅰ抗：MMP-2抗體（1∶1 000），TGF-β3和TIMP-1 抗體（1∶500）；HG+GAP19 組Ⅰ抗：NLRP3和P2X7R 抗體（1∶1 000），caspase-1 抗體（1∶500）；HG+CC 組Ⅰ抗：Cx43、NLRP3 和P2X7R 抗 體（1∶1 000），caspase-1 抗體（1∶500）；HG+α-LA 組Ⅰ抗：p-AMPK （Thr172）、Cx43、NLRP3 和P2X7R 抗 體（1∶1 000），caspase-1 抗體（1∶500）。4 ℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（或羊抗鼠）IgG，室溫下孵育2 h，洗膜，曝光成像后，以β-actin 為內(nèi)參照分析圖像。實驗重復3次。

3.4 ELISA 法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β、Col I、Col III 和ATP 水平 HG+MCC950 組：收集細胞培養(yǎng)上清液，按照IL-1β、Col I和Col III ELISA試劑盒操作要求檢測；HG+GAP19組、HG+CC 組和HG+α-LA 組：收集細胞培養(yǎng)上清液，按照ATP ELISA 試劑盒操作要求檢測。利用酶標儀在450 nm 波長處測定吸光度。實驗重復3次。

4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5 軟件進行統(tǒng)計學分析和制圖。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HG條件下細胞培養(yǎng)液中Col I和Col III含量

ELISA 結果顯示，HG 組細胞培養(yǎng)上清液中Col I含量顯著低于NG 組（P＜0.05），而兩組Col III含量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

Figure 1. Content of collagen type I （Col I） and Col III in the cell culture supernatants detected by ELISA. HG： high glucose. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vsnormal glucose （NG） group.圖1 正常糖組和高糖組細胞培養(yǎng)液中I型膠原和III型膠原的含量

2 抑制NLRP3 后大鼠胃平滑肌細胞中MMP-2、TGF-β3、TGF-β1 和TIMP-1 表達及細胞培養(yǎng)液中IL-1β、Col I和Col III含量

加入NLRP3 抑制劑MCC950 后，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)HG+MCC950 組胃平滑肌細胞中MMP-2 和TGF-β3 表達水平顯著低于HG 組（P＜0.01），而TGFβ1 和TIMP-1 表達水平顯著高于HG 組（P＜0.01），見圖2A。ELISA 結果顯示，HG+MCC950組細胞上清液中IL-1β 含量顯著低于HG 組（P＜0.01），而兩組之間Col I 和Col III 含量的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2B～D。

Figure 2. The protein expression of MMP-2， TGF-β3， TGF-β1 and TIMP-1 in rat gastric smooth muscle cells detected by Western blot， and the content of IL-1β， Col I and Col III in the cell culture supernatants detected by ELISA after treatment with NLRP3 inhibitor MCC950 （15 nmol/L）. A： the expression of MMP-2， TGF-β3， TGF-β1 and TIMP-1； B： the content of IL-1β； C： the content of Col I； D： the content of Col III. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs high glucose （HG） group.圖2 抑制NLRP3后大鼠胃平滑肌細胞中MMP-2、TGF-β3、TGF-β1和TIMP-1表達及細胞培養(yǎng)液中IL-1β、Col I和Col III含量

3 阻滯Cx43 后大鼠胃平滑肌細胞中NLRP3、caspase-1和P2X7R表達及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

加入Cx43 半通道阻滯劑GAP19 后，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HG+GAP19 組胃平滑肌細胞中NLRP3 和caspase-1 表達水平顯著低于HG 組（P＜0.01），而兩組之間P2X7R 表達的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3A。ELISA 結果顯示，HG+GAP19 組細胞上清液中ATP含量顯著低于HG組（P＜0.05），見圖3B。

Figure 3. The protein expression of NLRP3， caspase-1 and P2X7R in rat gastric smooth muscle cells detected by Western blot（A），and the content of ATP in the cell culture supernatants detected by ELISA （B） after treatment with Cx43 hemichannel blocker GAP19 （100 μmol/L）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs high glucose （HG） group.圖3 阻滯Cx43后大鼠胃平滑肌細胞中NLRP3、caspase-1和P2X7R表達及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

4 抑制AMPK 后大鼠胃平滑肌細胞中NLRP3、caspase-1、P2X7R 和Cx43 表達及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

加入AMPK 抑制劑CC 后，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)HG+CC組胃平滑肌細胞中NLRP3、caspase-1、P2X7R、總Cx43和胞膜Cx43蛋白水平及胞膜Cx43/胞漿Cx43比值均顯著低于HG 組（P＜0.01），見圖4A。ELISA結果顯示，HG+CC 組細胞上清液中ATP 含量顯著低于HG組（P＜0.01），見圖4B。

Figure 4. The protein expression of NLRP3， caspase-1， P2X7R and Cx43 in rat gastric smooth muscle cells detected by Western blot （A）， and the content of ATP in the cell culture supernatants detected by ELISA （B） after treatment with AMPK inhibitor Compund C （CC； 10 μmol/L）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vshigh glucose （HG） group.圖4 抑制AMPK后大鼠胃平滑肌細胞中NLRP3、caspase-1、P2X7R和Cx43表達及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

5 抗氧化應激后大鼠胃平滑肌細胞中p-AMPK、NLRP3、caspase-1、P2X7R 和Cx43 蛋白水平及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

加入抗氧化劑α-LA 后，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)HG+α-LA 組胃平滑肌細胞中p-AMPK、NLRP3、caspase-1、P2X7R、總Cx43 和胞膜Cx43 蛋白水平均顯著低于HG 組（P＜0.01），見圖5A。ELISA 結果顯示，HG+α-LA 組細胞上清液中ATP 含量顯著低于HG 組（P＜0.01），見圖5B。

Figure 5. The protein levels of p-AMPK， NLRP3， caspase-1， P2X7R and Cx43 in rat gastric smooth muscle cells detected by Western blot （A）， and the content of ATP in the cell culture supernatants detected by ELISA （B） after treatment with antioxidant α-lipoic acid （α-LA； 100 μmol/L）. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs high glucose （HG） group.圖5 抗氧化應激后大鼠胃平滑肌細胞中p-AMPK、NLRP3、caspase-1、P2X7R和Cx43蛋白水平及細胞培養(yǎng)液中ATP含量

討 論

胃平滑肌屬于單位平滑肌，由于其內(nèi)有一部分肌細胞屬于起搏細胞，且其興奮可通過豐富的縫隙連接向周圍的平滑肌細胞擴散，故而能夠形成一個功能單位。平滑肌細胞除了完成舒縮功能外，還有合成、分泌膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖及ECM 的作用。ECM 的合成和降解受多種因素調(diào)控。經(jīng)文獻回顧，我們認為氧化應激、AMPK、Cx43 和NLRP3 均可通過相關機制參與ECM的調(diào)控，且相互之間關系緊密。

NLRP3 可刺激下游caspase-1、IL-1β、IL-18 等物質的釋放，參與多種細胞行為的發(fā)生[9］；同時，TGF-β在細胞生長、分化、凋亡和ECM 重構中發(fā)揮著關鍵作用[10］。MMPs 是TGF-β 的下游，也一種促進ECM降解的中性內(nèi)肽酶，其中MMP-2 可以消化Col I、Col II和Col III。Col I和Col III是ECM 的主要組分，其含量變化可以反映ECM 的改變。TIMPs 是參與控制MMPs在組織中局部活性的特異性抑制劑，通常按照1∶1比例來結合MMPs，形成MMP-TIMP化合物，從而防止MMP 融合底物，抑制MMP 活性；這其中TIMP-1活性最強[11］。為確定氧化應激-AMPK-Cx43-NLRP3調(diào)控胃平滑肌ECM 重構的機制。本研究首先利用工具藥對HG 條件下體外培養(yǎng)大鼠胃平滑肌細胞的NLRP3 進行抑制（加入NLRP3 抑制劑），并檢測其下游相關蛋白表達及細胞上清液中IL-1β、Col I 和Col III 含量。結果發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3 后其下游MMP-2 和TGF-β3表達減少，而TGF-β1和TIMP-1表達增加，且細胞上清液中IL-1β 含量下降而Col I 和Col III 含量不變。學者研究認為，TGF-β3能夠通過抑制TGF-β1的功能進而抑制ECM 合成[12］，且NLRP3 炎癥小體活化是IL-1β 釋放的前提[13］。這表明，在HG 條件下，NLRP3 通過上調(diào)TGF-β3 而下調(diào)TGF-β1 表達，并進一步上調(diào)MMP-2 而下調(diào)TIMP-1 表達，從而調(diào)控胃平滑肌細胞Col I的分泌，參與ECM重構。

為探討Cx43 是否具有調(diào)節(jié)NLRP3 功能的作用，隨后我們在HG 條件下對體外培養(yǎng)胃平滑肌細胞的Cx43 進行了半通道抑制（加入Cx43 半通道阻滯劑），并檢測其下游的NLRP3、caspase-1、P2X7R 及細胞上清液中的ATP 含量。結果發(fā)現(xiàn)，抑制Cx43 后NLRP3和caspase-1 表達下降而P2X7R 表達不變，且細胞上清液中ATP 含量下降。研究認為，P2X7R 為ATP 門控離子通道，可調(diào)控多種生理功能，包括細胞死亡、炎癥過程等[14］。當細胞受損時，將向胞外釋放出大量ATP，細胞外ATP 與細胞膜表面的P2X7R 結合，打開孔隙通道，導致Ca2+內(nèi)流、K+外流。其中，胞內(nèi)K+外流將促進NLRP3 表達與NLRP3 炎癥小體的組裝，并釋放IL-1β 和IL-18[15］。這表明HG 條件下Cx43 通過上調(diào)胃平滑肌細胞ATP 的胞外釋放，增加ATP 與細胞膜表面P2X7R的結合，進而促進胞內(nèi)K+外流，增加NLRP3 表達并促進NLRP3 炎癥小體活化；而關于Cx43 的半通道開放是否參與K+外流，有待進一步研究。

HG 可誘導氧化應激的發(fā)生，而氧化應激又是激活AMPK 的上游因素。為此，接下來本實驗利用工具藥在HG 條件下先后對體外培養(yǎng)的大鼠胃平滑肌細胞AMPK 和氧化應激進行抑制，并檢測相應指標。結果發(fā)現(xiàn)，加入AMPK 抑制劑后NLRP3、caspase-1 和P2X7R 表達及胞外ATP 含量均下降，且Cx43 膜漿比下降；而加入抗氧化劑后，p-AMPK 蛋白水平下降，其余指標變化與加入AMPK 抑制劑后的變化類似。這表明HG 確實能夠通過氧化應激調(diào)節(jié)AMPK 的活性，進而調(diào)控Cx43的細胞再定位，改變Cx43的半通道開放，從而達到調(diào)節(jié)下游NLRP3 的功能，參與調(diào)控ECM重構的目的。

綜上所述，我們認為HG 通過氧化應激誘導AMPK-Cx43-NLRP3 通路活化，進而通過調(diào)節(jié)TGFβ3、TGF-β1、MMP-2 和TIMP-1 的生物學功能，參與了DGP大鼠胃平滑肌ECM的重構。