竹節參皂苷IVa通過抗炎和抗氧化減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷*

李林峽， 李 燕， 狄亞珍

（1寧波大學醫學部，浙江 寧波 315211；2杭州市兒童醫院兒內科，浙江 杭州 310000；3寧波市婦女兒童醫院風濕免疫科，浙江 寧波 315000）

急性肺損傷（acute lung injury， ALI）是指因不利因素導致的肺泡及毛細血管急性損傷，可引起彌漫性肺間質及肺泡水腫[1］。病理生理學研究認為ALI主要為炎癥和氧化應激反應造成的肺損傷。炎癥級聯反應和氧化應激是ALI 的發生和發展的重要的驅動因素[2］。ALI 嚴重患者在損傷后期若炎癥和氧化應激反應得不到有效控制可能會引發多器官衰竭，因此抗炎和抗氧化可為治療ALI 的關鍵策略[2-3］。竹節參皂苷IVa（saponin fromPanax japonicusIVa， SPJ IVa）為竹節參的根莖提取的齊墩果烷類活性化合物，現代藥理學研究表明其具有抗炎、抗氧化和免疫調節等廣泛的藥理作用[4-5］。已有研究報道，竹節參皂苷類化合物在腎纖維化、酒精肝、心肌梗死等動物模型中可通過抗炎和抗氧化程序緩解組織損傷[6-8］。而SPJ IVa 對ALI 的具體作用并不清楚。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）誘導的ALI 大鼠模型在病理形態學表現和疾病進展過程上與人ALI 具體很多相似之處，因此本研究采用氣管滴注LPS法構建ALI大鼠模型，探討SPJ IVa 對大鼠ALI 的影響并對其保護機制進行初步的探索。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

60 只6～7 周齡SPF 級雄性SD 大鼠，體重（200±20） g，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司[SCXK（滬）2022-0009］。SPJ IVa 粉末（上海源葉生物科技有限公司）；白細胞介素（interleukin， IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor， TNF）-α 大鼠酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒、GAPDH 抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；丙二醛（malondialdehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）檢測試劑盒、蘇木精-伊紅染（HE）色液和TUNEL 染色試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；LPS（0111：B4）（Sigma-Aldrich）；抗核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2， Nrf2）、血 紅 素 加 氧 酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、核因子κB（nuclear factorκB， NF-κB） p65、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）和cleaved caspase-3 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；SP 法免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；RIPA 裂解液、ECL 發光液、HRP標記Ⅱ抗（北京博奧森生物有限公司）；脫脂奶粉（上海生工生物工程有限公司）；PVDF膜（Millipore）。

2 方法

2.1 動物分組和造模 本研究符合實驗動物使用規范，實驗方案經動物倫理委員會批準。60只SD 大鼠適應性喂養1 周后，將其隨機分為4 組，每組15只，分別為對照（control）組、模型（model）組、低劑量SPJ IVa 組和高劑量SPJ IVa 組。以氣管內滴注2 mg/kg LPS 法構建ALI 大鼠模型[9］。低劑量SPJ IVa 組和高劑量SPJ IVa 組大鼠在ALI 造模后30 min，分別經腹腔注射給予15和45 mg/kg SPJ IVa（SPJ IVa的劑量參考文獻[5-8，10］和預實驗）。對照組大鼠氣管滴注與LPS 等體積的生理鹽水。造模24 h 后，麻醉各組大鼠，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid， BALF）；開腹暴露腹主動脈，抽取腹主動脈血2 mL，迅速注入含EDTA 的試管中充分搖勻，1 200×g離心20 min，取血清；安樂死后，收集肺組織。

2.2 肺組織濕/干重比值測定 以肺組織濕/干重比值評估大鼠肺水腫[2-3］。每組任選5 只大鼠的全肺，電子天平稱濕重后，將其置于恒溫箱溫度80 ℃干燥至干重恒定，稱量干重，計算肺組織濕/干重比值。

2.3 ELISA 檢測血清和BALF 中炎癥因子水平 按ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠血清和BALF 中炎性指標IL-1β、IL-6 和TNF-α 的水平，按照預制的標準曲線計算各指標的含量。

2.4 試劑盒法檢測血清及BALF中氧化應激因子水平 按ELISA 試劑盒說明書檢測大鼠血清和BALF中氧化應激分子MDA、SOD 和GSH-PX 的水平，按照標準曲線計算各指標的含量。

2.5 病理組織學觀察 按常規法用石蠟包埋肺組織，并制成5 μm 厚病理切片。切片經脫蠟水化后，用HE染色，光鏡下觀察病理改變。按文獻[11］方法對肺組織損傷進行評分。

2.6 免疫組化（immunohistochemistry， IHC）測定肺組織中cleaved caspase-3 表達情況 石蠟包埋的肺切片經脫蠟水化后，按SP 法免疫組化試劑盒步驟，進行免疫組化染色cleaved caspase-3（1∶200）。DAB顯色后，光鏡下觀察，每切片任選4個視野，用ImageJ軟件IHC profiler 插件將cleaved caspase-3 蛋白量化為IHC 積分，IHC 積分越高代表的cleaved caspase-3表達越高。

2.7 TUNEL 染色評估肺組織中細胞凋亡情況 以TUNEL 法檢測各組大鼠肺組織中細胞凋亡情況[3］。石蠟包埋的肺切片經脫蠟水化后，按TUNEL 染色試劑盒步驟，用蛋白酶K 處理30 min，洗滌后，每切片加50 μL TUNEL 檢測工作液（按試劑盒方法用TdT酶和熒光標記液現配）避光孵1 h，用PBS 洗滌，再用含DAPI 的封片液封片后，激光共聚焦顯微鏡下觀察，每切片任選4 個隨機視野進行TUNEL 陽性細胞計數。

2.8 Western blot 檢測肺組織中Nrf2、HO-1、NF-κB p65 和TLR4 表達情況 取制備好的肺勻漿加入RIPA 裂解液萃取細胞全蛋白。定量后，取20 μg 蛋白進行Western blot。將膜利用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h后，分別孵Nrf2（1∶2 000）、HO-1（1∶1 000）、NFκB p65（1∶1 000）、TLR4（1∶2 500）和GAPDH（1∶5 000），4 °C 過夜。次日，以TBST 洗滌后，室溫孵育HRP 標記的Ⅱ抗1 h。利用化學發光成像儀顯像，用ImageJ 軟件以GAPDH 為內參量化上述指標蛋白的表達情況。

3 統計學處理

該項目實驗數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，并利用Graphpad Prism 軟件進行后續統計學分析。多組定量資料的比較，采用單因素方差分析方法，組間均數兩兩比較采用Bonferroni法。當P＜0.05時差異被認為具有統計學意義。

結 果

1 SPJ IVa 可減輕LPS 誘導的ALI 大鼠肺組織病變和肺水腫

HE 染色結果顯示，對照組大鼠肺組織切片中肺泡結構完整，大小均勻，肺泡腔清晰，肺泡間隔明顯；模型組肺組織切片中肺泡結構不清、肺泡間隔消失，肺泡壁變厚，可見黏液和片狀出血情況；低、高劑量SPJ IVa 組肺組織形態較模型組有明顯改善，且高劑量組形態更趨向對照組。與對照組比較，模型組肺損傷積分和肺干/濕重比均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、高劑量SPJ IVa 組肺損傷積分和肺濕/干重比均顯著降低（P＜0.01），以高劑量組顯著。見圖1。

Figure 1. Saponin from Panax japonicus IVa （SPJ IVa） attenuated the morphological changes of lung tissues and pulmonary edema induced by LPS in rats. A： HE staining images（scale bar=100 μm） and lung injury score； B： lung dry/wet weight ratio.Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs control group； ##P＜0.01 vsmodel group.圖1 SPJ IVa減輕LPS所致大鼠肺組織病變和肺水腫

2 SPJ IVa 可減少LPS 所致ALI 大鼠肺組織細胞凋亡

TUNEL 染色（圖2A）顯示，與對照組比較，模型組肺組織TUNEL 陽性細胞增多（P＜0.01），而低、高劑量SPJ IVa 均能減少TUNEL 陽性細胞數量（P＜0.01）。免疫組化檢測（圖2B）顯示，與對照組比較，模型組肺組織cleaved caspase-3 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、高劑量SPJ IVa 組cleaved caspase-3表達水平均顯著降低（P＜0.01）。

Figure 2. Saponin from Panax japonicus IVa （SPJ IVa） attenuated LPS-induced apoptosis in lung tissues of rats. A： TUNEL staining；B： immunohistochemical staining for cleaved caspase-3. Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vscontrol group；##P＜0.01 vsmodel group.圖2 SPJ IVa減少LPS所致大鼠肺組織細胞凋亡

3 SPJ IVa可降低LPS所致ALI大鼠BALF和血清中促炎因子水平

如圖3 所示，與對照組比較，模型組大鼠BALF和血清中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低、高劑量SPJ IVa 組BALF 和血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.01）。

Figure 3. Saponin from Panax japonicus IVa（SPJ IVa） down-regulated proinflammatory factors in the BALF and serum of LPS-induced ALI rats. A～C： the levels of IL-1β （A）， IL-6 （B） and TNF-α （C） in the BALF； D～F： the levels of IL-1β （D）， IL-6 （E） and TNF-α （F） in the serum. Mean±SD. n=15. **P＜0.01 vscontrol group； ##P＜0.01 vsmodel group.圖3 SPJ IVa降低LPS所致ALI大鼠BALF和血清中促炎因子水平

4 SPJ IVa可改善LPS所致ALI大鼠BALF和血清中的氧化應激指標

如圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠BALF和血清中氧化指標MDA 水平顯著升高（P＜0.01），抗氧化酶SOD 和GSH 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低、高劑量SPJ IVa 組BALF 和血清中MDA水平顯著降低（P＜0.01），SOD 和GSH 水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 4. Saponin from Panax japonicus IVa （SPJ IVa） improved the oxidative stress indexes in the BALF and serum of LPS-induced ALI rats. A～C： the levels of MDA （A）， SOD （B） and GSH （C） in the BALF； D～F： levels of MDA （D）， SOD （E） and GSH （F） in the serum. Mean±SD. n=15. **P＜0.01 vscontrol group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vsmodel group.圖4 SPJ IVa改善LPS所致ALI大鼠BALF和血清中的氧化應激指標

5 SPJ IVa 對LPS 所致ALI 大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、NF-κB p65和TLR4表達的影響

Western blot 實驗（圖5）顯示，相較于對照組，模型組肺組織中Nrf2、HO-1、NF-κB p65 和TLR4 表達上調（P＜0.01）；與模型組比較，低、高劑量SPJ IVa 組Nrf2 和HO-1 表達進一步上調（P＜0.01），而NF-κB p65和TLR4表達顯著降低（P＜0.01）。

Figure 5. Effects of saponin from Panax japonicus IVa （SPJ IVa） on the protein expression of Nrf2， HO-1， NF-κB p65 and TLR4 in the lung tissues of LPS-induced ALI rats. A： Western blot was used to detect Nrf2 and HO-1 expression in lung tissues； B：Western blot was used to detect NF-κB p65 and TLR4 expression in lung tissues. Mean±SD. n=10. **P＜0.01 vscontrol group； ##P＜0.01 vsmodel group.圖5 SPJ IVa對LPS所致ALI大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、NF-κB p65和TLR4表達的影響

討 論

ALI 是一種發病率高、預后差的疾病，但目前有效的干預策略十分有限，因此迫切需要尋找新的治療藥物。本研究以氣管滴注LPS 法構建ALI 大鼠模型，并觀察到SPJ IVa 能改善LPS 所致ALI 大鼠肺組織病理形態改變，減輕肺水腫并降低肺組織細胞凋亡，說明SPJ IVa 是具有開發價值的治療ALI 的化合物。

本研究進一步探討了SPJ IVa抗大鼠ALI的潛在機制。炎癥反應是ALI 的重要病理特征和驅動因素[2，12-13］。TNF-α、IL-1β 和IL-6 是引起肺損傷的重要促炎介質，其可通過促進生成一系列炎癥細胞因子和趨化因子激活并放大炎癥級聯反應，造成肺內皮細胞和肺實質彌漫性損害[12-13］。因此，抑制或減輕炎癥反應是ALI的有效干預措施。SPJ IVa是從中藥竹節參提取出的具有抗炎和抗氧化的活性物質[5-8］，本研究觀察到SPJ IVa治療能抑制ALI模型大鼠血清和BALF 中促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平，提示SPJ IVa 在ALI 大鼠中發揮抗炎作用。NF-κB 信號是炎癥反應的關鍵的信號機制，激活NF-κB 能激活炎癥反應，而抑制NF-κB 通路則反之[2，13-15］。TLR4 是LPS 受體，LPS 能通過上調TLR4 激活NF-κB 信號，進而促進下游促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 釋放，激活炎癥反應[13-14］。本研究顯示，SPJ IVa 能降低LPS 致ALI 模型大鼠肺組織中NF-κB p65 和TLR4 的表達，說明SPJ IVa 可通過抑制TLR4/NF-κB 信號，減輕炎癥對ALI大鼠肺組織的損傷從而發揮其保護作用。

氧化應激在ALI 的發生和發展中發揮重要作用，ALI 的發生可使機體氧化物質增多，從而加重ALI[2-3，14-15］。MDA 是機體的脂質過氧化物，其水平可反映著機體氧化損傷嚴重程度[16］。SOD 與GSH 均是機體抗氧化系統中的主要成員，可分解過氧化物、脂質過氧化物，抑制脂質過氧化反應，其水平可反映機體清除氧自由基的能力[16-17］。本研究結果顯示，SPJ IVa治療可降低ALI大鼠中MDA水平，并提高抗氧化酶SOD 與GSH 的活力。Nrf2/HO-1 是重要的抗氧化信號，Nrf2 信號激活能通過HO-1 促進下游抗氧化酶SOD 與GSH 的合成，發揮抗氧化作用[7-8］。在動物模型中，已有大量研究表明激活Nrf2/HO-1 信號能減輕LPS 誘導的的ALI[14-17］。本研究觀察到SPJ IVa 治療的ALI 大鼠肺組織中Nrf2 和HO-1 表達上調，提示SPJ IVa 可能通過激活Nrf2/HO-1 信號促進ALI 大鼠體內的抗氧化酶生成從而減輕氧化應激對肺組織造成的損傷。

綜上所述，SPJ IVa 可通過抑制ALI 大鼠體內促炎因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的過度表達和提高抗氧化酶SOD 與GSH 水平，從而抑制ALI 后的失控性炎癥反應和氧化應激造成的急性肺損傷。此外，本研究還顯示，SPJ IVa 對ALI 模型大鼠的肺保護作用可能與其抑制TLR4/NF-κB 信號和增強Nrf2/HO-1 信號有關。