中性粒細胞胞外誘捕網浸潤促進尿道創傷后尿道成纖維細胞活化和增生性瘢痕形成*

陳燁輝， 許以城， 阮中天， 林婷婷， 薛學義， 許 寧

（福建醫科大學附屬第一醫院泌尿外科，福建 福州 350005）

尿道創傷后狹窄是臨床面臨的棘手問題之一。創傷后創面過度修復引起尿道組織瘢痕性增生是其發生的主要原因[1］。研究表明，創傷后創面局部炎癥過度激活，短期內使組織損傷加劇，創面遷延不愈，長期造成細胞外基質合成與降解失衡，促進瘢痕性增生[2］。對創傷后炎癥過程合理調控，避免尿道成纖維細胞過度活化與過多合成膠原，是防止創面過度修復引起瘢痕性增生的重要策略。

中性粒細胞胞外誘捕網（neutrophil extracellular traps， NETs）是一種中性粒細胞在細胞外產生的由組蛋白、DNA 和蛋白酶組成的網狀結構。NETs 以DNA 為骨架、其間鑲嵌多種蛋白成分，構成DNA-蛋白質復合物[3］。近年研究表明，NETs 參與創傷后炎癥過程[4］。此外，NETs 是腎纖維化、硬膜纖維化、動脈粥樣硬化等病理過程重要調控因素[5-7］。然而，NETs 對創傷后尿道瘢痕形成及尿道狹窄的發生作用仍未明確。本研究旨在探討尿道創傷后NETs 對尿道成纖維細胞的作用，及其對尿道瘢痕形成的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

改良型DMEM 培養液和胎牛血清購自購自Sigma；兔來源抗髓過氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）和瓜氨酸組蛋白H3（citrulline histone H3， CitH3）抗體購自Abcam；抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、I 型膠原（collagen type I， collagen I）和GAPDH 抗體均購自Affinity；脫氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I， DNase I）購自Merck；酶聯免疫吸附試劑盒購自Hycult Biotech；BCA 蛋白定量試劑盒購自Biosharp；CCK-8試劑盒購自Elabscience。

2 臨床樣本

20 例2021 年6 月 至2022 年12 月 期 間 于 福 建 醫科大學附屬第一醫院泌尿外科就診的尿道外傷患者，于創傷后24 h 內獲得其尿液與血液樣本，其中5例提供創傷后24 h 內的尿道組織樣本；20 例無尿道創傷的健康志愿者的尿液與血液樣本作為對照；5例作為對照的正常尿道組織取自前列腺增生手術患者；所有病例均需排除既往尿道手術史、合并尿路感染者。標本獲取已通過福建醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準（閩醫大附一倫理醫研[2019］035號），并通過患者及其家屬知情同意。

3 細胞來源及培養

從福建醫科大學附屬第一醫院泌尿外科手術病人獲取尿道瘢痕組織，參照文獻方法提取原代尿道成纖維細胞[8］。細胞于37 ℃、5% CO2、改良型DMEM培養液（含10%胎牛血清）條件下，傳代培養4～8 代用于后續實驗。標本獲取已通過福建醫科大學附屬第一醫院倫理委員會審核批準，并通過患者及其家屬知情同意。

4 主要實驗方法

4.1 尿道創傷動物模型 依照既往發表的方法構建動物模型[2］。本研究中動物實驗均經福建醫科大學實驗動物倫理委員會批準（閩醫大附一倫理醫研[2019］035 號），均符合實驗動物保護條例與實驗動物福利原則。采用2.5～3.5 kg 白色雄性新西蘭兔[普通級，SYXK（閩）2018-0002］，購自福建醫科大學動物實驗中心。建模步驟如圖1D 所示：（1）采用異氟烷持續性吸入麻醉（誘導麻醉濃度5%，維持濃度2.5%～3%）后，取仰臥位，固定四肢及頭部，會陰部碘伏消毒鋪巾；（2）置入F8 號導尿管引流膀胱內殘余的尿液，使用慶大霉素溶液沖洗膀胱，直到膀胱引流液變得清亮，輕輕牽拉陰莖；（3）沿著陰莖腹側切開，逐層切開暴露尿道，在距離尿道外口0.5～1 cm 處做一條長約0.5 cm 的橫切口。直到暴露出尿管，注意避開血管，保持術野清晰；（4）使用4.0 可吸收線逐層間斷縫合尿道黏膜和皮膚及皮下組織，縫線固定導尿管，沿著尿道外口0.5 cm處剪斷尿管，防止實驗兔對尿管的撕咬及尿管滑脫。術后給予口服頭孢地尼一周防止感染。構建尿道創傷動物模型完畢后，分組處理如下：非手術對照組、手術+轉化生長因子β1（transforming growth factor β1， TGF-β1）注射（陽性對照）組、手術+生理鹽水注射組、手術+DNase I 溶液注射組，干預藥物均在術后即刻尿道局部注射，術后12、24、48、72 h 檢測尿液中NETs 含量變化；2 個月后取尿道組織行Masson染色，檢測膠原纖維含量，評估瘢痕形成情況。

Figure 1. The level of NETs increased after urethral trauma. A： there was no statistically significant difference in the level of NETs in the blood between patients who had sustained urethral trauma （n=20） and healthy controls （n=20）； B： the level of NETs in the urine of patients who had sustained urethral trauma （n=20） was higher than that of healthy controls （n=20）. C： immunofluorescence microscopy images of NETs showed that samples from animals with urethral trauma （n=5） had a higher level of NETs than samples from the controls （n=5）. Blue： DAPI， Red： CitH3， Green： MPO. Scale bar=200 μm； D： the process of constructing the animal model of urethral trauma. Scale bar=1 cm； E： the level of NETs in the urine collected at various time points from animals with urethral trauma （n=20）. Mean±SD. *P＜0.05 vs control group.圖1 尿道創傷后NETs水平升高

4.2 人血中性粒細胞提取與NETs 的誘導 依照前人發表的方法提取中性粒細胞并體外誘導NETs[9］。取外周血，于無菌條件下加入1∶3 的紅細胞裂解液，混勻后室溫靜置15 min，250×g離心5 min 后，吸取上清，再次重復裂解紅細胞，留管底白細胞，加入含1%BSA 的PBS 液2 mL，充分混勻后加于預置4 mL 60%Percoll 的離心管液面上，500×g離心20 min。留管底中性粒細胞，用含有1% BSA 的PBS 洗2 次，獲中性粒細胞待用。佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（phorbol-12-myristate-13-acetate， PMA）是經典的NETs 刺激劑，用25 nmol/L 的PMA 刺激中性粒細胞2 h后，獲得NETs。

4.3 NETs 水平測定 采用酶聯免疫吸附法檢測NETs 中的MPO-DNA 復合物，以此對可溶性NETs 進行定量檢測[10］。用MPO抗體包被96孔板并在4 ℃過夜，充分洗滌后以1% BSA 封閉1 h。將樣本加入板中孵育1 h 后洗滌。隨后加入抗DNA-HRP 抗體孵育2 h。充分洗滌后加入100 μL 過氧化酶底物。隨后加入硫酸溶液終止反應并于450 nm波長下讀取吸光度（A）值。

4.4 Westen blot 提取總蛋白后，BCA 法測定蛋白濃度。配置分離膠和濃縮膠，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜。5%脫脂奶粉室溫下封閉處理2 h，浸于Ⅰ抗溶液中4 ℃孵育過夜，再浸于Ⅱ抗溶液中孵育30 min，PBS洗滌后顯影曝光。

4.5 CCK-8 實驗 將轉染24 h 細胞按照每孔1×103個的密度接種到96 孔板中，設置3 個復孔。在培養不同時間點（24 h、48 h 和72 h）將每個孔的培養液替換為含有10%的CCK-8試劑的等量新鮮培養液。繼續培養2 h 后，測定各孔在450 nm 波長的吸光度（A）值，繪制細胞活力曲線。

4.6 免疫熒光染色 組織標本以抗MPO 和抗CitH3 共染色區域占比，以顯示并定量NETs。切片并進行抗原修復后，加入抗MPO 和抗CitH3，于4 ℃下孵育過夜。充分洗滌后加入Ⅱ抗孵育30 min，洗滌后加入DAPI 避光孵育5 min，再次洗滌。封片后采集圖像。

4.7 Masson 染色與分析 石蠟切片脫蠟、蒸餾水洗，Weigert蘇木精液染5～10 min，充分水洗。用Masson 麗春紅酸性復紅液染5～10 min。以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min 后，用苯胺藍染5 min。以0.2%冰醋酸溶液浸洗片刻，依次95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。ImageJ 軟件分析圖像中染為藍色的膠原纖維部分所占組織面積的比例，以此定量組織纖維化程度。

5 統計學處理

應用SPSS 22.0 統計軟件分析，結果采用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組和多組間比較分別采用t檢驗和單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 尿道創傷后NETs水平升高

為明確NETs是否受尿道創傷影響，分別對20例尿道創傷患者和20 例健康對照組志愿者采取外周血和尿液標本，并檢測NETs 含量。結果顯示，外周血中NETs含量兩組無顯著差異（P＞0.05），且均處于較低水平（圖1A）；尿道創傷患者的尿液NETs 水平顯著高于對照組志愿者（P＜0.05）（圖1B）。對兩組患者尿道組織行免疫熒光染色鑒定NETs 水平，結果顯示尿道創傷組中組織NETs 水平顯著高于對照組（P＜0.05）（圖1C）。用新西蘭兔建立尿道創傷動物模型，在手術后不同時間點采集尿液，檢測NETs 水平變化趨勢。如圖1E所示，NETs在尿道創傷后早期階段，NETs 水平逐漸升高，24 h 左右處于峰值，隨后緩慢下降。

2 尿道創傷后NETs 水平越高，尿道瘢痕纖維化程度越高

為明確尿道創傷后NETs 水平升高是否參與尿道狹窄的形成，構建新西蘭兔尿道創傷模型，取術后24 h 尿液檢測NETs 水平，以＜0.5 mg/L、0.5～0.75 mg/L、＞0.75 mg/L 為標準，分為+、++、+++三組；2 個月后取尿道組織行Masson染色，檢測膠原纖維含量，評估瘢痕形成情況。如圖2 顯示，NETs 水平越高的分組，后續尿道組織膠原纖維含量越高，+++組比++組、++組比+組差異均有統計學意義（P＜0.05）。

Figure 2. The urethral scar became more severe as the level of NETs increased. A： representative images of Masson staining of collagen fibrosis in urethral tissue sections from rabbits of various groups. The blue-stained collagen fibers became denser as the level of NETs increased. Scale bar=100 μm. B： quantification of fibrotic area of urethral tissue from rabbits from various groups. Mean±SD. *P＜0.05 vs NETs（+） group； #P＜0.05 vs NETs（++） group.圖2 尿道創傷后NETs水平越高，尿道瘢痕纖維化程度越高

3 NETs促進尿道成纖維細胞活力與膠原合成

從人尿道組織中原代提取尿道成纖維細胞，如圖3A 所示，藍色熒光細胞核周圍分布密集條索狀的綠色熒光為α-SMA，即表明分離所得細胞確為尿道成纖維細胞。隨后，收集制備所得的NETs，免疫熒光染色顯示，綠色熒光（MPO）與紅色熒光（CitH3）重疊的梭形或條索狀結構為NETs（圖3B），用于后續實驗。分別加入0.1 mL 體積的生理鹽水、0.5 mg/L 的NETs（+）、1.5 mg/L 的NETs（++）溶液干預尿道成纖維細胞，以CCK-8 實驗評估其對細胞活力的影響。結果如圖3C 顯示，NETs 增強成纖維細胞活力（P＜0.05），且作用隨著NETs濃度升高而增強（P＜0.05）。同樣，劃痕實驗也顯示，NETs 促進成纖維細胞遷移（P＜0.05），且作用隨著NETs 濃度升高而增強（P＜0.05，圖3D）。此外，NETs 還促進α-SMA 與膠原纖維I 蛋白的表達（P＜0.05），且作用隨著NETs 濃度升高，其促進作用增強（P＜0.05，圖3E）。

Figure 3. NETs promoted activation of urethral fibroblasts and synthesis of collagen. A： immunofluorescence microscopy images of urethral fibroblasts. Blue： DAPI； green： α-SMA. Scale bar=30 μm. B： detection of NET formation by immunofluorescence in neutrophils treated with PMA. Blue： DAPI； green： MPO； red： CitH3. Scale bar = 200 μm. C： as the level of NETs increased， the cell viability of urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by the CCK-8 assay at 450 nm.D： as the level of NETs increased， the migration ability of urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by the wound healing assay. Scale bar=100 μm. E： as the level of NETs increased， the α-SMA and collagen I expression in urethral fibroblasts was enhanced； this was detected by Western blot analysis. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs NETs （+） group.圖3 NETs促進尿道成纖維細胞活化與膠原合成

4 DNase I 降低尿道創傷后NETs 水平和尿道瘢痕形成

進一步探索DNase I 是否能在動物水平拮抗NETs 對尿道瘢痕形成的作用。結果如圖4A 所示，DNase I 處理能顯著抑制手術引起的NETs 水平升高（P＜0.05）。2 個月后取尿道組織行Masson 染色，檢測膠原纖維含量，評估瘢痕形成情況。結果顯示，DNase I 處理顯著減少尿道組織中膠原纖維的含量（P＜0.05，圖4B）。此外，Western blot 檢測顯示DNase I處理顯著降低尿道瘢痕組織中α-SMA與膠原蛋白I的蛋白表達水平（P＜0.05，圖4C）。

Figure 4. DNase I reduced the level of NETs and suppressed the formation of urethral scar formation. A： levels of NETs in the urine collected at various time points from animals of various groups. B： Masson staining of collagen fibrosis from rabbits of various groups. The blue-stained collagen fibers became shorter and more loosely arranged when treated with DNase I. Scale bar=100 μm. C： α-SMA and collagen I expression was induced during treatment with DNase I. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs control group； #P＜0.05 vs operation group.圖4 DNase I降低NETs水平并抑制尿道瘢痕形成

討 論

尿道創傷是尿道狹窄的常見病因，導致不同程度排尿困難，嚴重者影響腎功能[11］。手術治療是主要的治療方式。尿道內切開手術操作簡便、微創、術后恢復快，但遠期療效欠佳，術后尿道再狹窄發生率高；開放性修復重建手術效果較好，但手術創傷較大、技術難度較高，也仍有術后復發的可能[12-13］。局部使用曲安奈德、紫杉醇、絲裂霉素C 等可減少尿道瘢痕形成[14-16］；我們既往研究也顯示Rho 激酶抑制劑、間充質干細胞等對尿道狹窄的預防具有一定效果[8，17］。但由于尿道創傷后修復及瘢痕形成機制未完全闡明，部分患者仍難取得滿意療效，術后出現狹窄復發。

尿道創傷后早期，受損組織與壞死細胞激活炎癥反應，趨化中性粒細胞聚集損傷區域[18］。中性粒細胞一方面分泌TNF-α、IL-1β 和IL-6 等擴大炎癥反應，一方面釋放蛋白酶清理壞死組織[19］。中性粒細胞是創傷后炎癥反應主要“執行者”。NETs 是中性粒細胞受某些因素刺激后，形成的以去聚化染色體DNA 為骨架、鑲嵌多種蛋白及細胞因子的網狀結構[20］。研究表明，NETs 在創傷后纖維修復過程中發揮重要調控作用[21］。Frangou 等[22］研究顯示在系統性紅斑狼瘡中，應激反應蛋白REDD1 與自噬介導NETs 形成，NETs 通過釋放組織因子和IL-17A，促進靶器官纖維化。Sukuki 等[23］研究表明NETs 是肺纖維化重要致病環節，模型小鼠PAD4基因敲除，能顯著減輕博來霉素誘導的肺纖維化。Hofbauer 等[24］報道NETs 過度生成是心梗后心室纖維化重構的重要原因。然而NETs 在尿道瘢痕形成過程中的作用既往仍未有研究闡明。本研究顯示，尿道創傷后，血液未檢測到NETs 水平升高，而尿液中則出現NETs 顯著升高，這表明NETs 改變僅局限于尿道創面局部，而并非全身性改變。研究結果還提示，這一現象與后期創面增生性瘢痕的纖維化程度可能密切相關。體外實驗進一步揭示NETs 促進尿道成纖維細胞活化與膠原合成可能是其內在機制。因此，NETs 可能是干預尿道瘢痕形成的一個潛在治療靶點。脫氧核糖核酸酶是NETs 有效的降解劑，并能明顯拮抗其作用[25］。在動物模型中DNase I 局部注射顯著抑制尿道瘢痕形成，這也初步證實此靶點的有效性。本研究存在一定不足之處，僅在細胞及動物模型層面初步驗證了NETs 對尿道成纖維細胞活化及瘢痕形成的影響；然而，NETs 作為一個攜帶多種分子的DNA-蛋白質的網狀結構，究竟是其中的何種信號分子對下游表型起作用？具體的信號傳導途徑和細胞機制是什么？仍需進一步研究。

綜上所述，本研究證明NETs 通過促進尿道成纖維細胞的活化與膠原合成，參與尿道創傷后創面修復與瘢痕增生的調控過程。DNase I 可抑制NETs 生成，從而減輕尿道增生性瘢痕。這或可為治療創傷后尿道狹窄提供參考。