醬油品質指標的比較與抗氧化能力的研究

張智勇，王宇婷，熊思瑞，周明印，喬祺，金鐵巖

延邊大學農學院（延吉 133002）

隨著“健康中國”口號的打響，越來越多的消費者選擇食品的最大關注點不僅局限于口味，也在向注重健康以及功能性方面靠攏。醬油中除了原料大豆中本身含有的不飽和脂肪酸、多糖、大豆異黃酮等物質，還會在發酵過程中由微生物代謝生產出的生理活性物質，如多肽、類黑精、呋喃酮等[1]。醬油作為人們日常生活中不可或缺的調味品，具有極高的營養價值。根據研究表明，醬油具有抗氧化活性、抗高血壓、抗高血脂、抗腫瘤活性、抗過敏活性等[2]作用。醬油除了作為滿足人們日常需求的調味品外也是攝取生理活性成分的重要載體，在日常生活中可以從醬油中攝取生理活性成分。醬油含有多種抗氧化劑，如酚類化合物、異黃酮、類黑素、游離氨基酸和超氧化物歧化酶，染料木苷與大豆苷等具有很強的抗氧化活性，它們是醬油中異黃酮類物質的主要組成。而類黑素是由醬油在美拉德反應中生成的一種褐色色素，這種褐色色素內部具有穩定的自由基結構，且不會受到消化酶影響，能夠消除羥自由基、過氧化物等[3]。已報道關于醬油生理活性功能的研究探索很少，對醬油風味和釀造工藝的相關研究也較少，所以全面加強醬油營養以及提高醬油品質質量是當前研究的關鍵。試驗以木桶發酵醬油為原料，分析其一般成分、功能性成分及抗氧化活性，為今后研發功能性醬油提供理論依據與數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

木桶發酵醬油由好記食品釀造股份有限公司提供（代號S1）；其余5種均購于延吉市百貨大樓超市（代號分別為S2、S3、S4、S5、S6）。試驗所用醬油試樣信息如表1所示。

表1 6組醬油的基本信息

1.1.2 試驗儀器與設備

分析天平（YP2002，上海科教儀器有限公司）；pH計（FE28，梅特-托利多精密儀器有限公司）；色差儀（CM-5，日本柯尼卡美能達公司）；紫外可見分光光度計（Alpha-1900Splus，上海譜元儀器有限公司）；電感耦合等離子體質譜儀（PlasmaQuant MS，德國耶拿公司）；氨基酸自動分析儀（L-8900，島津上海實驗器材有限公司）；原子吸收光譜儀（ICE 3300，賽默飛世爾科技中國有限公司）；恒溫水浴鍋（HH-2，天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030，上海一恒科學儀器有限公司）；恒溫氣浴振蕩器（THZ-72S5，常州市國旺儀器制造有限公司）。

1.1.3 試驗試劑

石油醚、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、溴甲酚綠指示劑、無水乙醇、1,1-2-苦肼基（DPPH）標準品、ABTS標準品、鹽酸、硫酸、過氧化氫、水楊酸、鉬酸銨、磷酸鈉等（均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司）；水使用GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規格和實驗方法》規定的一級水。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬油理化指標的測定

1.2.1.1 銨鹽含量參照GB 5009.234—2016《食品安全國家標準食品中銨鹽的測定》測定醬油中銨鹽含量。

1.2.1.2 氯化鈉含量

參照GB 18186—2000《釀造醬油》測定醬油中氯化鈉含量。

1.2.1.3 氨基酸態氮及總酸含量的測定

參照GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態氮的測定》中的酸度計法，測定醬油中氨基酸態氮及總酸含量。

1.2.2 醬油中礦物質含量的測定

參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體質譜法（ICPMS）進行測定。

1.2.3 醬油色度的測定

使用柯尼卡美能達CM-5型色差儀測定醬油的色度。

1.2.4 醬油中氨基酸含量的測定

1.2.4.1 醬油氨基酸成分檢測

醬油前處理參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》中的方法對醬油進行水解。

1.2.4.2 醬油氨基酸營養價值評價

根據聯合國糧農組織/世界衛生組織（FAO/WHO）推薦的模式[4-5]，蛋白質的營養價值需使用必需氨基酸評分對其進行評價，具體如式（1）所示。

1.2.5 醬油中多酚和總黃酮含量測定

1.2.5.1 醬油中多酚含量的測定

以沒食子酸作為標準品進行定量。參考舒更新[6]的方法測定總酚含量。繪制標準曲線，方程為y=0.0145x-0.0564（R2=0.9998）。

1.2.5.2 醬油中總黃酮含量的測定

根據楊春霞等[7]的方法稍作修改，測定總黃酮含量。繪制標準曲線，方程為y=0.0011x+0.0318（R2=0.9985）。

1.2.6 醬油的體外抗氧化活性

1.2.6.1 醬油的DPPH自由基清除能力

用蒸餾水配制質量濃度分別為0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的醬油溶液，作為待測樣品備用。取2 mL待測樣品加入2 mL 0.04 g/L的DPPH無水乙醇溶液，混合均勻，反應20 min，測其在517 nm波長處吸光度，記為A1；另取2 mL待測樣品加入無水乙醇2 mL，反應20 min，測其在517 nm波長處吸光度，記為A2；測定2 mL 0.04 g/L DPPH無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇在517 nm波長處吸光度A0，所有測定平A0行進行3次，取平均值。通過式（2）計算醬油對DPPH自由基清除率（%）。

式中：A0為樣品+DPPH的吸光度的吸光度；A1為樣品+無水乙醇的吸光度的吸光度；A2為無水乙醇+DPPH的吸光度。

1.2.6.2 醬油的ABTS+自由基清除能力

7 mmol/L ABTS+與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，于室溫靜置16 h，制備成ABTS+儲備液。臨測前使用溶液將儲各液稀釋至吸光度2.00±0.10工作液。將醬油試樣用蒸餾水配制質量濃度分別為0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的溶液，作為待測液備用。取0.3 mL樣品溶液與3 mL ABTS充分混勻6 min后于734 nm處測定吸光度Ai；同樣方法，取3 mL蒸餾水與0.3 mL樣品溶液混合，測定吸光度Aj，取3 mL ABTS與0.3 mL蒸餾水混合，測定吸光度A0，通過式（3）計算醬油溶液對ABTS自由基清除率（%）。

式中：Ai為樣品組吸光度；Aj為對照組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.2.6.3 醬油的鐵離子還原能力

分別移取5 mL質量濃度0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的醬油稀釋液于試管中，加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖液和濃度0.1%的鐵氰化鉀溶液各5 mL，50 ℃下保溫25 min后加入5 mL 10%三氯乙酸溶液。取5 mL反應好的溶液后加入5 mL蒸餾水和1 mL 0.1%三氯化鐵溶液后靜置10 min，在700 nm處測定其吸光度[8]。

1.2.6.4 醬油的總抗氧化能力

醬油用蒸餾水配制成質量濃度分別為0.10，0.25，0.50，1.00，2.00和3.00 mg/mL的醬油溶液樣品，備用。取0.4 mL醬油稀釋液，加入4 mL磷鉬酸試劑（28 mmol/L磷酸鈉、0.6 mol/L濃硫酸和4 mmol/L鉬酸銨），在95 ℃恒溫水浴90 min，測定695 nm波長處吸光度[9]。

2 結果與分析

2.1 醬油理化指標的分析

由表2可知，不同醬油試樣間的的氨基酸態氮、氯化鈉、全氮、乙醇、無鹽固形物、銨鹽含量存在差異。氨基酸態氮的含量在0.97～1.28 g/100 g之間，S2與S5含量顯著低于其他4種，S1顯著高于其他5種。氯化鈉含量在15.68～16.66 g/100 mL之間，S1與S3氯化鈉含量最低，二者之間無顯著性差異，S2與S5含量最高并無顯著性差異，而S4的氯化鈉含量與S1、S3之間無顯著性差異但顯著低于S6。全氮含量在1.64%～2.17%之間，蛋白質含量在10.14%～13.58%之間，各組醬油試樣之間存在顯著差異（P＜0.05），S1全氮含量（2.17%）均顯著高于其他5組試樣，按照由高到低的順序依次為S1＞S3＞S6＞S4＞S2＞S5。在乙醇含量上，S3顯著高于其他5組醬油試樣，含量為2.41%，S1乙醇含量最低，為1.18%。6組試樣的無鹽固形物含量在22.90～28.34 g/100 mL之間，S4含量為28.34 g/100 mL，顯著高于其他5組，S6與S1、S3之間無明顯差異，但S1無鹽固形物含量顯著高于S3，S2無鹽固形物含量為最低。銨鹽含量在0.20～0.32 g/100 mL之間，S1的銨鹽含量顯著高于其他5組醬油，S4的銨鹽含量為最低，但與S2、S5之間無顯著性差異，S6與S2之間無顯著性差異，S3與S2、S6之間無顯著性差異，但S3顯著高于S5和S4。S4的pH顯著高于其他5組，S3與S6之間明顯差異，但卻顯著高于S1、S2和S5。

表2 6組醬油的理化指標

2.2 醬油中礦物質含量的分析

由表3可知，醬油中含有宏量元素4種分別為鉀、鈣、鈉和鎂，微量元素5種分別為鐵、鋅、硒、錳和鉬。宏量元素鉀含量最高的是S6，含量為5628.73 mg/kg；鈣含量最高的S1，含量為185.77 mg/kg；鈉含量最高的為S2，含量為48845.67 mg/kg；鎂含量最高的為S3，含量為850.60 mg/kg。微量元素種鐵含量最高的是S4，含量為26.12 mg/kg，顯著高于其他5組醬油（P＜0.05）；鋅含量最高的為S6，含量顯著高于其他5組，為8.44 mg/kg，S4的鋅含量最低，含量為6.47 mg/kg；微量元素硒含量S1含量為0.06 mg/kg，顯著低于其他5組，其他5組之間的硒含量無顯著性差異；S3錳含量為最高，為16.71 mg/kg，鉬含量S5最高，為0.39 mg/kg，S1最低，為0.13 mg/kg。

表3 6組醬油礦物質元素的含量 單位：mg/kg

2.3 醬油色度的分析

6種零添加醬油色度的比較如表4所示。6組醬油試樣的L*值、a*值、b*值均存在顯著性差異（P＜0.05）。還可以看出6組醬油試樣的L*值、a*值、b*值按高低順序依次為S6＞S5＞S4＞S3＞S2＞S1。S1醬油試樣的L*值、a*值、b*值均顯著低于其他5種醬油試樣，醬油L*值、a*值、b*值的不同對醬油的成分味道無影響，對烹飪時醬油對菜肴的上色程度略有影響[10]。

2.4 醬油中氨基酸含量的分析

氨基酸的含量與醬油的營養、風味密切相關，是衡量其質量的一個重要指標[63]。由圖1～圖7可知，六組醬油試樣的圖譜與標準圖譜相互對應，S1、S2、S3、S4、S5、S6分別檢測出17種氨基酸，其中7種為必需氨基酸，通過醬油試樣的峰面積計算出氨基酸含量，結果如表5所示。

圖1 氨基酸標準圖譜

圖2 S1醬油試樣氨基酸圖譜

圖3 S2醬油試樣氨基酸圖譜

圖4 S3醬油試樣氨基酸圖譜

圖5 S4醬油試樣氨基酸圖譜

圖6 S5醬油試樣氨基酸圖譜

圖7 S6醬油試樣氨基酸圖譜

表5 6組醬油中氨基酸含量 單位：g/100 g

由表5可知，醬油中氨基酸中種類多樣，含量豐富，6組醬油試樣均檢測出17種氨基酸，S1、S2、S3、S4、S5、S6這6組醬油試樣的氨基酸總量分別為4.71，3.15，3.95，3.66，3.14和3.39 g/100 g。人體必需氨基總量分別為1.50，1.07，1.38，1.10，1.09和1.14 g/100 g；非必需氨基酸總量分別為3.21，2.08，2.57，2.56，2.05和2.25 g/100 g。谷氨酸、天冬氨酸和脯氨酸在6組醬油中含量較高，比其他非必需氨基酸更豐富。谷氨酸參與許多重要的化學反應及生物代謝。半胱氨酸和酪氨酸含量相較其余15種相對較少。醬油含有7種人體必需氨基酸。除S6外，其他5組中必需氨基酸含量最高的種類為亮氨酸，在必需氨基酸中又有一部分氨基酸稱為支鏈氨基酸，其中包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，亮氨酸負責促進蛋白質的合成和改善新陳代謝。它是支鏈氨基酸中最重要的一種[64]。而S6中賴氨酸的相對含量較高，賴氨酸對人體的發育具有有效的促進作用，增強免疫功能與中樞神經組織的功能。

在6組醬油試樣中，S1支鏈氨基酸總含量為0.82 g/100 g，其次是S3支鏈氨基酸總含量（0.72 g/100 g）和S5支鏈氨基酸總量（0.58 g/100 g），最后是S2，S4和S6的支鏈氨基酸，總含量均為0.56 g/100 g。在6組醬油試樣的支鏈氨基酸中亮氨酸含量最均為豐富，亮氨酸作為支鏈氨基酸中最重要成分，具有促進蛋白質合成和增加能量代謝等功效[11]。

從表6可以看出，6組醬油試樣的呈味氨基酸總量按高低順序依次為S1＞S3＞S4＞S6＞S2＞S5。在所有風味氨基酸中，與苦味氨基酸相比，S1的鮮味與甜味氨基酸的含量之和具有較高的差值。這說明S1在口感上很容易讓人接受。

表6 6組醬油呈味氨基酸組成 單位：g/100 g

根據6組醬油中每組氨基酸含量，計算必需氨基酸在氨基酸總量中的質量分數，并將其與FAO/WHO的標準譜進行比較。從表6可以看出，S1與S4的蘇氨酸比例低于FAO/WHO模式，只有S4的纈氨酸低于FAO/WHO模式。6組醬油的異亮氨酸比例整體高于FAO/WHO模式，亮氨酸比例只有S4和S6低于FAO/WHO標準模式，賴氨酸評分除S1外均高于FAO/WHO模式，6組醬油試樣中蛋氨酸和苯丙氨酸的比例全部低于FAO/WHO的標準模式。說明6組醬油都具有一定營養價值。

由表7可知，6組醬油中的苯丙氨酸與蛋氨酸比例低于FAO/WHO評分模式，說明苯丙氨酸以及蛋氨酸含量較欠缺，苯丙氨酸缺乏會影響體內酪氨酸合成，從而導致甲狀腺素水平降低[12]。蛋氨酸對人體內的氮元素代謝有著重要的作用，如果沒有足夠的蛋氨酸，就會讓嚴重影響正常的新陳代謝，進而產生各種疾病。

表7 6組醬油7種必需氨基酸評分 單位：%

2.5 醬油體外抗氧化性的分析

2.5.1 醬油DPPH自由基清除能力

由圖8可知，0.5 mg/mL時，6組醬油試樣清除自由基能力為22.61%～33.72%。6組醬油試樣的自由基清除能力以劑量依賴的方式提高，DPPH清除能力隨著醬油濃度的增加而增加。這表明，醬油的質量濃度對抗氧化能力有直接影響，這與前人的研究一致[98]，即提取物的質量濃度越高，即多酚，與提取物的抗氧化活性直接相關[13]，因為多酚具有作為質子供體的能力[14]。醬油樣品中的不同化合物可以以類似的方式受到影響。當S2的清除率達到91.57%時，其質量濃度為2 mg/mL，顯著高于其余5組的清除率（P＜0.05）。3 mg/mL時，6組醬油試樣的清除DPPH自由基能力趨于平緩。而S1顯著高于其他五組醬油試樣（P＜0.05），6組醬油試樣的抗氧化活性IC50值分別為S1（0.704 mg/mL）、S2（0.888 mg/mL）、S3（0.751 mg/mL）、S4（0.846 mg/mL）、S5（0.838 mg/mL）和S6（0.987 mg/mL）。

圖8 6組醬油的DPPH自由基清除能力

2.5.2 醬油ABTS自由基清除能力

由圖9可知，醬油質量濃度與對ABTS自由基的清除能力呈正相關，且6組醬油清除ABTS自由基的能力與其清除DPPH自由基能力規律一致。

圖9 6組醬油的ABTS自由基清除能力

質量濃度從0.1 mg/mL到0.5 mg/mL時，S1的清除率范圍為12.57%～24.56%，在設定的每個濃度范圍內都顯著高于其他5組試樣（P＞0.05）。1.0 mg/mL時，S1與S3對ABTS自由基的清除率沒有顯著差異。3 mg/mL時，S1表現出最高的ABTS自由基清除率（70.64%），高于S2、S3、S4、S5、S6對ABTS自由基的清除率（59.24%，65.79%，63.16%，59.49%和58.36%）。6組醬油試樣除S2與S6之間無顯著差異外，其他組樣之間均有顯著差異。由此看出，在試驗濃度范圍內，S1對ABTS自由基的清除能力較好，其IC50值為1.636 mg/mL。其余5組醬油的IC50值分別為S2（2.357 mg/mL）、S3（1.872 mg/mL）、S4（2.068 mg/mL）、S5（2.758 mg/mL）和S6（2.577 mg/mL）。結合前人的研究，不難得出醬油清除ABTS自由基的能力與DPPH自由基的清除能力相比之下較弱。醬油清除ABTS自由基的能力均較弱[15]。

2.5.3 醬油的鐵離子還原能力

由圖10可知，在鐵離子還原試驗中測得的吸光度越高，說明醬油的還原力越高，即其抗氧化能力越高。6組醬油的還原能力與質量濃度呈正相關，其還原能力隨濃度的增大而增強。質量濃度0.1～1 mg/mL時，6組樣品之間在同一濃度下的吸光度無明顯差異，在0.1 mg/mL時S2顯著高于其他五組，在0.5 mg/mL時S2除顯著高于S1與S5外，與其余3組之間無顯著差異（P＞0.05）。2 mg/mL時，6組醬油試樣之間的鐵離子還原能力開始出現顯著差異，S3顯著高于其余5組，S2與S1、S4之間無顯著差異，但顯著高于S5與S6，S6吸光度最低，為0.10。3 mg/mL時，S3與S4之間無顯著差異，S1、S2、S4和S5之間也無顯著性差異（P＞0.05），但S3顯著高于S1、S2、S5和S6（P＜0.05），S6的吸光度最低，說明S6的鐵離子還原能力低。3 mg/mL時，S3和S4具有較還原力。

圖10 6組醬油的鐵離子還原能力

2.5.4 醬油的總抗氧化能力

由圖11可知，總抗氧化能力試驗中測得的吸光度越大則表示醬油的抗氧化能力越強[16]，6組醬油的總抗氧化能力與質量濃度呈正相關，其能力隨濃度的增大而增強。0.10和0.25 mg/mL時，6組樣品之間在同一濃度下的吸光度無差異不明顯。0.50～3.00 mg/mL時，S1的總抗氧化能力開始逐漸顯現，顯著高于其他5組，其他5組醬油之間的總抗氧化能力雖然較S1來說較弱，但可以從圖中看出其總抗氧化能力與樣品的質量濃度呈正相關關系，隨著質量濃度的增大，樣品的總抗氧化能力也在增強。S1的總抗氧化能力為6組試樣中最強，吸光度為0.12。3.00 mg/mL時，吸光度為0.26，從上升趨勢來看，S1的總抗氧化能力隨著濃度的增大而逐漸增強。

圖11 6組醬油的總抗氧化能力

3 結論

以木桶發酵醬油與玻璃纖維發酵罐發酵醬油為試驗對象，研究二者之間的理化指標、氨基酸含量、礦物質元素含量，并且通過測定6組供試醬油的多酚與總黃酮含量，及6組供試醬油的體外抗氧化活性，進行比較研究。

結果表明，木桶發酵醬油的氨基酸態氮含量1.28 g/100 mL、全氮含量2.17%，均為6組試樣中最高。6組醬油中檢測出礦物質元素種類9種，分別為鉀、鈣、鈉、鎂4種宏量元素，以及鐵、鋅、硒、錳和鉬5種微量元素。檢測出氨基酸種類17種，木桶發酵醬油S1的氨基酸總量及必需氨基酸總量均為試驗組中最高。所有醬油都含有總多酚和總黃酮，S1的多酚和黃酮類化合物含量（分別為4.43和1.87 mg/g）均高于另外5組醬油。6組醬油都具有一定的抗氧化能力。但木桶發酵醬油更加突出，6組醬油的還原能力和抗氧化能力隨著質量濃度的增加而逐漸顯現，在濃度相同的條件下，S1的抗氧化能力明顯高于其他5組。在相關分析中，6組醬油的抗氧化能力與多酚和黃酮類物質，在相關分析中，6組醬油的抗氧化能力與多酚和黃酮類物質呈正相關。