類胡蘿卜素對中華鋸齒米蝦體色的影響

張元長

(詔安縣水產技術推廣站，福建 漳州 363500)

中華鋸齒米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)隸屬節肢動物門(Arthropod)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、匙指蝦科(Atyidae)、新米蝦屬(Neocaridina)[1]，是亞洲的原生物種，廣泛分布于河流、湖泊和水庫中，因品系繁多、生存能力強、繁殖周期短、易于飼養等特性而深受水族愛好者的青睞。除具有觀賞價值外，中華鋸齒米蝦還具有世代周期短、大型卵、成活率高等特點，是理想的實驗和科研材料。野生中華鋸齒米蝦體色半透明、部分體色不透明、帶有灰色樹枝狀條紋、少見紅色和藍色體色，而選育的中華鋸齒米蝦體色主要有紅色、黃色、藍色、橙色、透明色、黑色、琉璃色等色系。目前，有關中華鋸齒米蝦的研究[2-8]主要集中在其生殖系統發育、性別分化、生理生化、毒理和胚胎發育及結構變化等方面，但關于其體色改良的研究則鮮見報道。

甲殼類動物蝦青素代謝轉化途徑分為兩大類：一類是將β-胡蘿卜素轉化為蝦青素，如對蝦類；另一類是直接利用中間產物葉黃素轉化為蝦青素，如龍蝦和螃蟹[9-10]等。目前，已知類胡蘿卜素超過600種，可分為分子中含氧原子的葉黃素類和不含氧原子、只含碳氫的胡蘿卜素類兩大類，其中類胡蘿卜素的重要代表蝦青素和葉黃素可作為色素添加劑而被廣泛應用于動物飼料，以增加動物體色鮮艷度[11]。蝦青素是甲殼類動物主要的呈色物質，但受提煉工藝不成熟且不易獲取的影響，將其用于養殖活動會提高生產成本；而人工合成蝦青素是通過化學方式合成的，產量高，成本低，但合成產物含有左旋(3S，3′S)、內消旋(3S，3′R)和右旋(3R，3′R)3種蝦青素(同分異構體)[12]。螺旋藻的β-胡蘿卜素含量為177.95 mg/100g，其被廣泛應用于對蝦飼料[13]。雖然大部分生物的體色主要由遺傳物質控制，但是通過添加類胡蘿卜素色素對體色產生的增艷效果可以提升其觀賞和經濟價值[14-17]。因此，本實驗以紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦為研究對象，根據薄層色譜分析結果挑選中華鋸齒米蝦的類胡蘿卜素添加劑(螺旋藻粉、葉黃素、天然蝦青素和人工合成蝦青素)，探究類胡蘿卜素添加劑對其體色的影響，為提升工廠化養殖觀賞蝦類體色鮮艷度提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦購于廈門本地的米蝦養殖場，在實驗室暫養14 d，暫養期間使用不含色素添加劑的飼料。

薄層色譜實驗：β-胡蘿卜素(標準品)和蝦青素(標準品)，上海甄準生物科技有限公司。P-20E型全自動薄層色譜點樣儀，上海科哲生化科技有限公司；TK-20E全自動展開儀，上海科哲生化科技有限公司；Goodsee-10型薄層色譜成像儀、200 mm×200 mm薄層板，上海科哲生化科技有限公司。展層劑∶石油醚∶丙酮∶正丙醇=90∶10∶0.45；0.1% BHT抗氧化劑∶稱取0.1 g BHT藥品放入裝有石油醚溶液的100 mL容量瓶中進行溶解，然后用石油醚定容，保存備用。

投喂實驗：潘通色卡(PANTONE)為國際通用的標準色卡。天然蝦青素和人工合成蝦青素，長江水產研究所；螺旋藻粉，廈門嘉康飼料有限公司；葉黃素，廣州立達爾生物科技股份有限公司；對蝦配合飼料(不含色素飼料添加劑)，廈門嘉康飼料有限公司。

1.2 薄層色譜分析

分別分離紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦的真皮層組織(色素細胞層)，進行細胞破碎，再稱取10 g破碎組織(濕重，未投喂添加劑)進行色素提純、薄層色譜分離和分析中華鋸齒米蝦蝦體的色素成分。色素提取和展開步驟參考楊壽鈞[18]和李楊等[19]所使用的方法。

1.3 類胡蘿卜素投喂實驗

1)根據薄層色譜分析結果選擇類胡蘿卜素添加劑。

2)在實驗組飼料中分別添加的類胡蘿卜素含量為天然蝦青素200 mg/kg、人工合成蝦青素200 mg/kg、葉黃素200 mg/kg、螺旋藻粉20 g/kg[20-25]。

3)將中華鋸齒米蝦放入玻璃魚缸(15 cm×20 cm×30 cm)飼養，分為2組排序編號，分別給予正常光照和黑暗環境，采用充氣過濾循環系統。

4)實驗開始前，在紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦中，各隨機抽取10只中華鋸齒米蝦進行體色比對。

5)實驗設置：分別設置連續光照和黑暗條件。(1)光照組：光照強度為2 000 lx，紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦分別設置4個實驗組(分別添加天然蝦青素、人工合成蝦青素、葉黃素、螺旋藻粉)和1個對照組(不含飼料添加劑)，每組設置3個平行，每個平行10只中華鋸齒米蝦。光照組共設置45個魚缸。(2)黑暗組：紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦分別設置4個實驗組(分別添加天然蝦青素、人工合成蝦青素、葉黃素、螺旋藻粉)和1個對照組(不含飼料添加劑)，每個組設置3個平行，每個平行10只中華鋸齒米蝦。黑暗組共設置45個魚缸，魚缸四周貼上不透光塑料板片，上方用遮陽網遮蓋。

6)實驗在室溫25 ℃[水溫(26±1)℃]的恒溫條件下進行，pH 為7.0，氨氮為0 mg/L，亞硝酸鹽為0 mg/L。周期為7 d，每天定時投喂1次，待中華鋸齒米蝦腸道飽滿并離開攝食臺后，開始吸污，并換水1/3。

7)觀察指標：實驗結束后，將各組中華鋸齒米蝦第二腹節的體色與潘通色卡進行比對，獲得顏色型號，根據顏色型號找到相應的顏色組成，即透明度和子顏色，兩者占比之和為100%。記錄并分析色度值，并在解剖鏡下分別觀察光照和黑暗條件下對照組中華鋸齒米蝦體色的色素狀態。

1.4 數據分析

為便于分析中華鋸齒米蝦體色的顏色型號，將Pro.Blue、ReF.Blue和Drak Blue的總和稱為藍色度值(Blue)；Warm Red、Rub.Red、Red032和Bright Red的總和稱為紅色度值(Red)；Yellow012和Yellow的總和稱為黃色度值(Yellow)；Orange021為橙色度值(Orange)；其他顏色(Other)占比非常小，因而忽略不計。蝦體色的顏色組成為：Trans.Wt+Blue+Red+Orange+Yellow+Other=100%，式中Trans.Wt為透明度值，該值越大，表示體色越淺。

實驗結果采用SPSS 20.0進行單因素方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 薄層色譜分析中華鋸齒米蝦色素成分及飼料添加劑選擇

薄層色譜分析結果顯示，藍色、紅色、黃色3個品系中華鋸齒米蝦分別含有6個、5個、3個條帶，并且都有相似的條帶，說明3個品系中華鋸齒米蝦含有相同的色素成分。對比3個品系中華鋸齒米蝦與β-胡蘿卜素、蝦青素標準品的薄層色譜結果，發現3個品系中華鋸齒米蝦均具有2種標準品的條帶，說明其均含有β-胡蘿卜素和蝦青素(圖1)。因此選擇含有β-胡蘿卜素的螺旋藻和蝦青素作為實驗飼料色素添加劑。

注：Y.黃色品系；R.紅色品系；B.藍色品系；C.β-胡蘿卜素(標準品)；A.蝦青素(標準品)。自下而上第一個點為起始點。Notes:Y.The yellow strain;R.The red strain;B.The blue strain;C.β-carotene (standard);A.Astaxanthin(standard).The first point from bottom to top was the starting point.

2.2 連續光照條件下不同色素添加劑對中華鋸齒米蝦體色的影響

在連續光照條件下，3個品系中華鋸齒米蝦的存活率為100%，但3個品系的各實驗組和對照組中華鋸齒米蝦的體色均發生了不同程度的變化。

在紅色品系中：1)葉黃素組的中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)最低(13.19%)，與實驗前相比差異顯著(P<0.05)，與對照組和螺旋藻組相比無顯著差異(P>0.05)，與天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)。2)螺旋藻組的中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)最大(54.87%)，與實驗前相比差異顯著(P<0.05)，與對照組、葉黃素組和天然蝦青素組相比無顯著差異(P>0.05)，與人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)。3)葉黃素組的中華鋸齒米蝦體色的黃色值(Yellow)最大(19.23%)，與實驗前、對照組、螺旋藻組和天然蝦青素組相比無顯著差異(P>0.05)，與人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)。4)各組中華鋸齒米蝦體色的橙色值(Orange)無顯著差異(P>0.05)(圖2)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母無差異。以下同此。Notes:Groups with different letters showed significant difference (P<0.05);groups with the same letter showed no difference.The same as below.

在黃色品系中：1)天然蝦青素組中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)最低(31.17%)，與實驗前、對照組、螺旋藻組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)，與葉黃素組相比無顯著差異(P>0.05)。2)各組中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)無顯著差異(P>0.05)。3)天然蝦青素組中華鋸齒米蝦體色的的黃色值(Yellow)最大(77.73 %)，與實驗前、對照組、螺旋藻組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)，與葉黃素組相比無顯著差異(P>0.05)。4)各組中華鋸齒米蝦體色的橙色值(Orange)無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

在藍色品系中：1)天然蝦青素組中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)最低(53.02%)，與實驗前、對照組、螺旋藻組、葉黃素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)。2)各組中，中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)和黃色值(Yellow)均無顯著差異(P>0.05)。3)天然蝦青素組中華鋸齒米蝦體色的藍色值(Blue)最大(77.73%)，與實驗前、對照組、螺旋藻組、葉黃素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)(圖4)。

以上結果顯示，連續光照對紅色品系中華鋸齒米蝦的紅色素呈現出抑制效果。天然蝦青素對黃色和藍色2個品系中華鋸齒米蝦體色的促進效果最明顯，與實驗前相比分別提升29.56%和14.85%，與對照組相比分別提升26.31%和21.15%。

2.3 黑暗條件下不同色素添加劑對中華鋸齒米蝦體色的影響

在黑暗條件下，3個品系中華鋸齒米蝦的存活率為100%，其中部分實驗組的體色發生不同程度的變化。

在紅色品系中：1)各組中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)無顯著差異(P>0.05)。2)人工合成蝦青素組中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)最大(46.66%)，與實驗前相比無顯著差異(P>0.05)，與對照組、螺旋藻組相比差異顯著(P<0.05)，與葉黃素組和天然蝦青素組相比無顯著差異(P>0.05)。3)對照組中華鋸齒米蝦體色的黃色值(Yellow)最大(17.79%)，與實驗前和4個實驗組相比差異顯著(P<0.05)，而實驗前，4個實驗組蝦體之間的黃色值無顯著差異(P>0.05)。4)實驗前中華鋸齒米蝦體色的橙色值(Orange)最大(42.81%)，螺旋藻組和葉黃素組的橙色值與對照組、天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)，天然蝦青素組和人工合成蝦青素組的橙色值與對照組之間無顯著差異(P>0.05)(圖5)。

在黃色品系中：1)實驗前中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)最低(49.73%)，與對照組和螺旋藻組相比差異顯著(P<0.05)，與葉黃素組、天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比無顯著差異(P>0.05)，對照組與4實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。2)各組中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)無顯著差異(P>0.05)。3)實驗前中華鋸齒米蝦體色的黃色值(Yellow)最大(49.73%)，與對照組和螺旋藻組相比差異顯著(P<0.05)，與葉黃素組、天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比無顯著差異(P>0.05)，對照組與4個實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。4)各組中華鋸齒米蝦體色的橙色值(Orange)無顯著差異(P>0.05)(圖6)。

在藍色品系中：1)實驗前中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)最低(67.87%)，與對照組、螺旋藻組、葉黃素組、天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)，對照組與4個實驗組之間無顯著差異(P>0.05)。2)各組中華鋸齒米蝦體色的紅色值(Red)和黃色值(Yellow)無顯著差異(P>0.05)。3)實驗前中華鋸齒米蝦體色的藍色值(Blue)最大(29.17%)，與對照組、螺旋藻組、葉黃素組、天然蝦青素組和人工合成蝦青素組相比差異顯著(P<0.05)，對照組與4個實驗組之間無顯著差異(P>0.05)(圖7)。

綜上所述，在黑暗條件下，人工合成蝦青素對紅色品系中華鋸齒米蝦體色中的紅色具有一定的維持效果；天然蝦青素對黃色品系中華鋸齒米蝦體色的黃色具有一定的維持效果；4種色素添加劑對藍色品系中華鋸齒米蝦的體色均不具有維持效果。

2.4 光照和黑暗條件下對照組中華鋸齒米蝦體色色素狀態對比

在本實驗結束后，通過對比光照和黑暗條件下對照組3個品系中華鋸齒米蝦體色的色素狀態，發現在黑暗條件下中華鋸齒米蝦體色的色素發生收縮或聚集反應(圖8)。光照組(圖8：A1、B1、C1)中華鋸齒米蝦體色的色素伸展程度明顯比黑暗組(圖8：A2、B2、C2)高，并且體色顏色也更深，說明適當的光照可以使中華鋸齒米蝦體色更鮮艷。

注：A.紅色品系；B.黃色品系；C.藍色品系；1.光照條件；2.黑暗條件。Notes：A.The red strain；B.The yellow strain；C.The blue strain；1.Under light condition；2.Under dark condition.

3 討論

3.1 中華鋸齒米蝦的色素成分差異

對紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦的色素薄層色譜分析發現，3個品系都含有β-胡蘿卜素和蝦青素，但同時存在不同的條帶，可能是類胡蘿卜素的氧化代謝程度不同所致，說明不同品系對類胡蘿卜素的氧化代謝程度有所差異[9]。

從薄層色譜分析結果可以推測，紅色和黃色2個品系中華鋸齒米蝦體色的色素成分包含β-胡蘿卜素和蝦青素。而在對藍色品系中華鋸齒米蝦進行色素提取時，發現加入石油醚后，其體色很快由藍色變為紅色。有研究指出，在藍色龍蝦中含有甲殼藍蛋白，而甲殼藍蛋白遇到石油醚會發生蛋白質變性而失活[26]。再結合薄層色譜分析結果，推測藍色品系中華鋸齒米蝦體色的色素可能含有甲殼藍蛋白與蝦青素的結合物。因此，選擇蝦青素和富含β-胡蘿卜素的螺旋藻作為飼料色素添加劑。而葉黃素作為β-胡蘿卜素轉化為蝦青素的中間產物，其含量在生物體中相對較少，因而無法被薄層色譜分離并顯示出來，但是作為類胡蘿卜素的重要代表之一，其也能提升甲殼類動物的體色[9-10]。因此，本研究也同時將葉黃素作為飼料色素添加劑。

3.2 不同光照條件、不同類胡蘿卜素對中華鋸齒米蝦體色的影響

本實驗結果表明，在不同光照條件下，不同類胡蘿卜素對不同品系的中華鋸齒米蝦體色的呈色效果表現出差異，其原因可能是不同品系的中華鋸齒米蝦對不同氧化級別的類胡蘿卜素的響應有所不同，并且一定的光照能夠促進黃色和藍色品系中華鋸齒米蝦對類胡蘿卜素的轉化和利用。

在連續光照條件下，紅色品系的中華鋸齒米蝦體色的透明度值(Trans.Wt)比實驗前均有所降低，說明體色在一定程度有所增加；紅色值(Red)結果顯示，最大值為對照組，最小值為人工合成蝦青素組，并且存在顯著差異；部分實驗組的黃色值(Yellow)和橙色值(Orange)與對照組和實驗前相比都有一定程度的提升，但差異不顯著。這可能有3種原因：1)從色素狀態來看，長時間的光照會影響色素收縮，普通光連續照射可使紅色素體發生色素聚集[27-28]。當色素體發生集聚時，紅色素體外圍會因紅色素濃度降低而表現出橙色(圖8：A1)。2)從色素合成上分析，在實驗后期可能受到某些因素的抑制。類胡蘿卜素的氧化途徑位于線粒體內膜上，而在氧化過程中葉黃素形成的2，3-脫氫葉黃素和由玉米黃質形成的3，3’-二脫氫葉黃素是更有效的β-胡蘿卜素雙加氧酶2(BCDO2)氧化應激誘導劑，其會破壞線粒體內膜的氫離子(H+)平衡[29]，因此為避免這兩種物質造成的破壞，將其排除在線粒體外，或者進一步氧化，但該步驟需要損耗更多的氧。目前光動力效應致靶細胞線粒體損傷的機制研究表明，長期光照可使細胞內光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)發生光漂白，導致HMME含量降低，線粒體在光敏化反應中產生較多的活性氧自由基，從而對其造成損傷[30]。因此，光照對紅色品系的中華鋸齒米蝦的線粒體造成了一定的損傷，而為了滿足機體的正常呼吸需求，線粒體將類胡蘿卜素的大部分氧化途徑關閉，造成了中間產物的顏色出現積累。3)在實驗過程中，24 h連續光照使對照組的魚缸出現藻類生長，作為底棲動物的中華鋸齒米蝦不停地抓食藻類而補充類胡蘿卜素，導致對照組體色顏色加深。

在連續光照條件下，在黃色和藍色2個品系中，天然蝦青素組的中華鋸齒米蝦體色的透明度(Trans.Wt)均比實驗前和對照組低，但其主要顏色黃色值(Yellow)和藍色值(Blue)均比實驗前和對照組高，說明天然蝦青素對黃色和藍色2個品系中華鋸齒米蝦體色具有顯著的促進作用。研究表明，每克干魚體質量含有的色素量與天然蝦青素含量和投喂時間成正比[31-32]，如以50 mg/kg蝦青素飼料投喂缺乏蝦青素的對蝦4周后，其體色逐漸恢復至深青藍色，并且還從蝦殼中分離出類胡蘿卜素[33]；在不同的色素添加劑中表現出顯著差異，說明黃色和藍色2個品系中華鋸齒米蝦對不同色素添加劑的吸收利用率不同，如分別以蝦青素和角黃素喂食虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，若要達到同樣的著色效果，角黃素需72 mg/kg，而蝦青素只需60 mg/kg，說明蝦青素較角黃素的著色效率更高[34]；投喂相同濃度的β-胡蘿卜素、角黃素和蝦青素，發現蝦青素在組織中的積累量分別比角黃素和β-胡蘿卜素高23%和43%[25]。在黃色和藍色2個品系中華鋸齒米蝦中，人工合成蝦青素組與天然蝦青素組均表現出顯著差異，這可能是由蝦青素結構、功能和成分上的差異導致，蝦青素具有左旋(3S，3′S)、內消旋(3S，3′R)和右旋(3R，3′R)3種同分異構體，而人工合成蝦青素是以內消旋(3S，3′R)為主的3種結構的混合物，與養殖生物體內的蝦青素以左旋(3S，3′S)為主截然不同[35]；在生理功能方面，人工合成蝦青素的穩定性和氧化活性均比天然蝦青素差[36]，并且在其合成過程中會產生其他化合物，從而降低其生物利用安全性[37]。

在黑暗條件下，不同類胡蘿卜素對不同品系的中華鋸齒米蝦體色的影響不同，其原因有：1)黑暗環境對中華鋸齒米蝦吸收和利用蝦青素影響很大。有研究表明，在不同光照條件下投喂相同含量的蝦青素飼料，黑暗條件下的凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)體內的蝦青素含量明顯低于光照條件下[38]；2)黑暗條件對色素的狀態也有影響。劉麗等[39]研究發現紅劍魚(Xiphophorushelleri)的紅色素在黑暗條件會產生收縮或聚集反應。在本實驗結束后，通過比較光照和黑暗條件下3個品系的對照組色素狀態(圖8)，也發現了與劉麗等[39]相似的結果。

4 結論

1)3個品系的中華鋸齒米蝦含有的色素物質不同。紅色、黃色和藍色3個品系中華鋸齒米蝦的色素均含有β-類胡蘿卜素和蝦青素，藍色品系的中華鋸齒米蝦色素可能含有甲殼藍蛋白與蝦青素的結合物。

2)在不同光照條件下，類胡蘿卜素添加劑及對不同品系的中華鋸齒米蝦的體色影響存在差異。在光照條件下，紅色品系的中華鋸齒米蝦體色的紅色素受連續光照影響，導致色素出現聚集反應，使類胡蘿卜素對其體色的促進效果不明顯；在黃色和藍色品系的中華鋸齒米蝦中，天然蝦青素對其體色的促進效果最明顯，與實驗前相比分別提升29.56%和14.85%，與對照組相比分別提升26.31%和21.15%。在黑暗條件下，葉黃素、天然蝦青素和人工合成蝦青素對紅色和黃色品系的中華鋸齒米蝦體色具有一定的促進、維持效果；4種類胡蘿卜素添加劑對藍色品系中華鋸齒米蝦體色均不具有維持效果。