燈盞花乙素增強4T1 乳腺癌細胞對順鉑敏感性的體內外研究

張 琦，包小波，田沖沖

（江蘇醫藥職業學院藥學院，江蘇鹽城 224005）

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤[1]。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）及人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均為陰性的一種特殊乳腺癌亞型，約占乳腺癌總數的15%[2]。TNBC 是乳腺癌治療中最棘手一種，具有發病年齡早、惡性程度高、侵襲性強、復發率高、易發生肝腦器官轉移等特點[3]。TNBC 患者的預后較差，如果患者在確診時沒有發生轉移，其5 年生存率可達65%～90%，但不幸的是，有約46%的患者會出現遠處轉移，而一旦發生轉移，患者的中位生存期僅為13.3 個月[4-5]。由于其特殊的分子表型，TNBC 對內分泌治療和分子靶向治療均不敏感，化療仍然是TNBC 的主要的系統治療手段，但化療效果卻不盡如人意[6-7]。順鉑（cisplatin，CDDP）是治療TNBC 的重要化療藥物。作為一種鉑類烷化劑，CDDP 通過與細胞的 DNA 結合，形成鏈內或鏈間交聯，導致 DNA 雙鏈斷裂損傷，達到抗腫瘤作用[8]。雖然 CDDP 對TNBC 的治療具有較好的療效[9-11]，但是隨著治療時間延長，TNBC 會對CDDP 產生耐藥性，導致疾病的進一步發展和預后不良[12]。因此，提高機體對 CDDP的化療敏感性對TNBC 的臨床治療具有重大意義。

燈盞花是中國傳統中藥材之一，除具備藥用價值以外，其還被開發應用于食品如飲茶及化妝品領域[13-15]。燈盞花乙素（scutellarin，SCU）是從燈盞花中提取的一種黃酮苷[16]。研究指出，SCU 具有重要而廣泛的藥理活性，包括抗炎[17]、抗氧化[18]、抗纖維化[19]、抗凋亡[20]和抗腫瘤[21-22]等生物活性。此外，SCU 還有一定的化療增敏作用。比如姚俠等[23]的研究表明SCU 能通過下調三結構域蛋白（tripartite motif-containing protein 32，TRIM32）的表達增強卡鉑的抗卵巢癌活性。Gao 等[24]也證實SCU 能夠以劑量依賴的方式增加前列腺癌細胞對CDDP 的敏感性。但關于SCU 聯合CDDP 在TNBC 治療方面，目前尚無報道。

因此，本研究采用乳腺癌細胞4T1 為研究對象，體外探究SCU 聯合CDDP 對4T1 的直接作用，并且建立4T1 荷瘤小鼠模型，體內觀察兩者聯合用藥對腫瘤生長的影響，從而探討聯合治療抑制乳腺癌發生與發展的作用機制，為TNBC 的治療提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性BALB/c 小鼠24 只（體重16±2 g）江蘇華創信諾醫藥科技有限公司提供（動物許可證號：SCXK（蘇）2020-0009）。飼養于江蘇醫藥職業學院SPF 級動物房（實驗動物使用許可證：SYXK（蘇）2018-0008）。飼養條件：溫度24.0±1.0 ℃，相對濕度40%～70%，晝夜交替進行光照，自由飲水和進食。所有操作均符合動物倫理學要求和實驗動物管理條例，本實驗已通過江蘇醫藥職業學院動物倫理委員會批準（編號2020011）；4T1 細胞株 中科院上海細胞庫；胎牛血清、RPMI-1640 培養基 美國Gibco 公司；0.25%胰酶（1:250）Biosharp 生物科技公司；燈盞花乙素粉末 昆明龍津藥業有限公司；順鉑 齊魯制藥（海南）有限公司；Martrigel 基質膠、Transwell 小室 Corning 公司；烏拉坦 上海山浦化工有限公司；肝素鈉注射液 上海上藥第一生化藥業有限公司；多聚甲醛 天津科密歐化學試劑有限公司；Annexin V 細胞凋亡檢測試劑盒、PCR 引物 博士德生物工程有限公司；蘇木素-伊紅（H&E）染色液Solarbio 公司；總RNA 提取試劑Trizol、RNA 逆轉錄合成cDNA 試劑盒 Thermofisher 公司；PCR 試劑盒 Roche 公司；β-actin 抗體、Caspase-3 抗體、Bax 抗 體、Caspase-9 抗 體、Cleaved-Caspase-3 抗體、Cleaved-Caspase-9 抗體、Bcl-2 抗體 Abcam公司。

HF90 細胞培養箱 上海力申儀器有限公司；醫用超凈工作臺 江蘇蘇凈集團有限公司；XD-202 倒置顯微鏡 德國ZEISS 公司；游標卡尺 世達工具有限公司；ELX808 酶標儀 美國BIOTEK 公司；TS-1000 脫色搖床 其林貝爾儀器制造有限公司；YB5001B 電子太平 上海衡際科學儀器有限公司；DY89-II 電動玻璃勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 4T1 細胞培養 將4T1 細胞培養于含10%的胎牛血清的RPMI-1640 培養基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。采用0.25%胰酶常規消化細胞并傳代。

1.2.2 CCK-8 實驗 參考Cao 等[25]的方法，取對數生長期的4T1 細胞以8×103個/孔的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于培養箱中培養24 h 后，分別加入不同濃度梯度的藥物：CDDP（0、10、20、40、80 μmol/L）、SCU（0、25、50、100、200 μmol/L）以及聯合用藥組CDDP+SCU（80 μmol/L+200 μmol/L）；同時設置空白對照組（無4T1 細胞），每組6 個復孔。48 h 后，向每孔中添加CCK-8 溶液10 μL，孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm 處的光密度（OD）值，計算細胞增殖率。上述實驗單獨重復3 次。

1.2.3 細胞劃痕實驗評估細胞的遷移能力 參照張媛等[26]的方法，取對數生長期的4T1 細胞接種于6 孔板中，待細胞生長密度達80%左右時用100 μL槍頭在孔中劃一條直線，PBS 沖洗后，分別加入2 mL 不含血清的RPMI-1640 培養基與CDDP（80 μmol/L）組、SCU（200 μmol/L）組、聯合用藥組（CDDP+SCU）培養液，培養24 h 后拍照，實驗單獨重復3 次。

1.2.4 Transwell 實驗評估細胞的侵襲能力 參考張媛等[26]的實驗方法并進行修改。將Transwell 小室放入24 孔板中，在小室的上室中加入50 μL Martrigel基質膠，置于37 ℃培養箱中5 h，待Martrigel 基質膠凝固后，將收集到的4T1 細胞用無血清的RPMI-1640 培養基重懸細胞，按2×105個/孔的密度接種至Transwell 上室中，并加入含200 μL 無血清培養基。下室加入600 μL 用完全培養基配制的不同濃度藥物溶液（80 μmol/L CDDP，200 μmol/L SCU，CDDP+SCU），于培養箱培養48 h。取出上室，經無水酒精固定后，結晶紫染色，雙蒸水沖洗后于顯微鏡下隨機選取5 個相同密度細胞的視野進行觀察拍照，觀察并計算各組細胞穿出膜的數量。每組設置3 個復孔，實驗單獨重復3 次。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 使用流式細胞術檢測SCU 聯合CDDP 對4T1 細胞凋亡的影響。收集對數生長期的4T1 細胞，0.25%胰酶常規消化，1000 r/min 離心5 min 去除上清，接種于6 孔板中，培養24 h 后使細胞匯合度達到80%左右，分別加入不同濃度的藥物溶液進行干預。24 h 后分別收集CDDP（80 μmol/L）組、SCU（200 μmol/L）組、聯合用藥組（CDDP+SCU）處理過的4T1 細胞，4 ℃，1500×g，5 min 離心去上清。加入預冷的PBS 緩沖液洗滌細胞，4 ℃，1500×g，5 min 離心去上清，重復2 次。利用雙蒸水稀釋5×Binding Buffer 為1×Binding Buffer，每管加入500 μL 的1×Binding Buffer 重懸細胞。每管加入5 μL 的異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，FITC）及10 μL 的碘化丙啶（Propidium Iodide，PI），輕柔混勻，室溫避光孵育10 min。最后，每管加入400 μL 的PBS 緩沖液稀釋細胞，并于1 h內進行檢測。

1.2.6 荷瘤小鼠模型的建立 參考Pulaski 等[27]的方法建立4T1 荷瘤小鼠模型，即4T1 細胞經胰酶消化后，用RPMI-1640 培養基重懸并調整細胞濃度為1×107個/mL，接種于BALB/c 小鼠股溝皮下，每只0.1 mL（1×106個細胞）。

1.2.7 實驗動物分組及給藥 BALB/c 小鼠皮下注射接種4T1 細胞后，根據前期預實驗結果確定給藥濃度，并隨機分為4 組，每組6 只：對照組（生理鹽水）、60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組和SCU+CDDP 組，接種后第7 d 腫瘤開始長出，按上述分組腹腔注射相應劑量的藥物，之后每24 h 腹腔給藥一次，共給藥11 次。

1.2.8 小鼠稱重以及采集腫瘤組織樣本 小鼠每天稱重；待小鼠體內腫瘤長出后，用游標卡尺每隔1 d 測量腫瘤長徑（a）與短徑（b），記錄并計算小鼠腫瘤體積（V=1/2ab2）。待小鼠腫瘤最大直徑約為10 mm 時，20%（w/v）烏拉坦腹腔注射麻醉小鼠，用1 mL 注射器抽取腹腔靜脈血，剝離腫瘤組織，稱重并拍照，將腫瘤組織投入到預先配好的4%（w/v）多聚甲醛中固定。

1.2.9 腫瘤組織病理染色 將腫瘤組織固定在4%多聚甲醛中，將固定的腫瘤組織在分級乙醇溶液中脫水，二甲苯透明，浸入石蠟，包埋制成蠟塊。將組織蠟塊切成約5 μm 厚的組織切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蘇木素浸泡3 min，1%鹽酸乙醇分化，0.6%氨水返藍，純水洗滌。滴加伊紅染液約3 min，在95%乙醇中梯度脫水，二甲苯清洗10 min，中性樹膠封片。置于光學顯微鏡下觀察并采集圖像。用Image-Pro Plus 軟件分析染色圖片，計算各組腫瘤組織中的微血管密度（microvascular area，MVA）。

1.2.10 實時熒光定量PCR 檢測腫瘤組織中凋亡因子轉錄水平的表達 Trizol 分離提取腫瘤組織中總的RNA，將RNA 逆轉錄為cDNA，反應在20 μL 體系中進行，反應體系：1 μL qPCR 引物，1 μL cDNA產物，10 μL SYBR Green qPCRMaster Mix（2×）。擴增條件：預變性95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環40 次。溶解曲線60～95 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃。以GAPDH 為內參基因，通過目的基因定量拷貝數=2-△△CT方法分析數據。基因引物序列見表1。

表1 本研究中使用的引物序列Table 1 Sequences of primers used in the present study

1.2.11 Western Blot 檢測腫瘤組織中凋亡因子蛋白水平的表達 稱取腫瘤組織50 mg，加入RIPA 組織裂解液，在電動玻璃勻漿機中研磨，提取總蛋白，整個提取過程置于冰上進行。用BCA 試劑盒檢測各組樣品蛋白濃度。各取30 μg 總蛋白進行SDS-PAGE電泳，電轉印法進行轉膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗繼續室溫孵育1 h，ECL 顯色并拍照。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達。

1.3 數據處理

所有細胞實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS 23.0 統計軟件對數據進行統計和分析；采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞增殖的影響

首先在體外采用CCK-8 實驗考察單獨使用SCU、CDDP 以及SCU 聯合CDDP 給藥對4T1 細胞的增殖抑制作用。當使用濃度為10、20、40、80 μmol/L 的CDDP 處理細胞48 h 后，與空白對照組相比，各組4T1 細胞的相對增殖率分別為91.14%、80.23%、65.33%和41.83%。其中，當CDDP 濃度為40 μmol/L 時，4T1 的增殖率明顯減少，差異具有顯著意義（P＜0.05）；增大濃度到80 μmol/L 時，4T1的增殖率進一步降低，與空白對照組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01）（圖1A）。當使用濃度為25、50、100、200 μmol/L 的SCU 處理細胞后，與空白對照組相比，各組4T1 細胞的相對增殖率分別為92.67%、88.12%、78.16%和62.50%。其中，當SCU 濃度為100 μmol/L 時，4T1 的增殖率明顯減少，差異具有顯著性（P＜0.05）；增大濃度到200 μmol/L 時，4T1 的增殖率進一步降低，與空白對照組相比，差異具有極顯著意義（P＜0.01）（圖1B）。基于上述實驗結果，選擇200 μmol/L SCU 與80 μmol/L CDDP 聯合（SCU+CDDP）作用于4T1 細胞并觀察其對細胞增殖的影響。實驗結果如下：200 μmol/L SCU、80 μmol/L CDDP 以及SCU+CDDP 對細胞的相對增殖率分別為60.12%、58.23%和26.63%，與空白對照組相比，各組均具有極顯著性差異（P＜0.01）。其中，與200 μmol/L SCU 及80 μmol/L CDDP 相比，SCU+CDDP 對4T1 的抑制作用更為明顯，差異具極顯著意義（P＜0.01）（圖1C）。上述結果表明加入SCU 聯合用藥后能夠增強CDDP 對4T1 細胞的增殖抑制作用。

圖1 CDDP、SCU 及SCU 聯合CDDP 對4T1 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of CDDP,SCU and CDDP+SCU on the proliferation of 4T1 cells

基于抗增殖實驗的結果，選擇200 μmol/L SCU、80 μmol/L CDDP 以及SCU+CDDP 進行后續的遷移與侵襲實驗。

2.2 SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響

通過細胞劃痕實驗檢測各組藥物對4T1 細胞遷移能力影響，結果如圖2 所示，相比于空白對照組，200 μmol/L SCU 組與80 μmol/L CDDP 組4T1 細胞遷移能力均下降，且結果具有極顯著性差異（P＜0.01），SCU 單藥組細胞劃痕面積愈合率為51.21%±4.32%，CDDP 單藥組細胞劃痕面積愈合率為40.33%±4.38%，并伴隨少量細胞的脫落壞死，細胞向中線遷移減慢；而SCU+CDDP 聯合用藥組細胞遷移能力明顯減弱，細胞劃痕面積愈合率為21.78%±4.18%，幾乎未見細胞向中線遷移，表明SCU 聯合CDDP 能更有效抑制乳腺癌4T1 細胞的遷移能力，與空白對照組以及SCU 和CDDP 單用組相比，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。

圖2 CDDP、SCU 及SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞遷移的影響Fig.2 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on the migration capacity of 4T1 cells

本研究又進行了Transwell 實驗，檢測各組藥物作用于4T1 細胞48 h 后對腫瘤細胞侵襲能力的影響。如圖3 所示，與空白對照組相比，200 μmol/L SCU 組與80 μmol/L CDDP 組穿過小室膜細胞數均極顯著減少（P＜0.01），表明4T1 細胞侵襲能力減弱；SCU 與CDDP 聯合用藥組穿過小室膜細胞數減少更為顯著，作用更明顯，表明聯合用藥對4T1 細胞的侵襲能力抑制作用最強，加入SCU 后能夠增強CDDP 對乳腺癌4T1 細胞的抑制作用，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。

圖3 CDDP、SCU 及SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞侵襲的影響Fig.3 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on the invasion capacity of 4T1 cells

2.3 SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞凋亡的影響

為了進一步考察SCU 對CCDP 抗腫瘤增敏作用，采用流式細胞術檢測兩藥單用和聯合對4T1 腫瘤細胞凋亡的影響。檢測結果如圖4 所示，與空白對照組相比，SCU 組、CDDP 組凋亡率增加，分別為32.26%、47.87%，差異具有極顯著性意義（P＜0.01）；而SCU+CDDP 聯合用藥組凋亡率更高，凋亡率為71.53%，與單用SCU 或CDDP 組相比，差異具有極顯著性（P＜0.01），提示SCU 能增強CDDP 對乳腺癌4T1 細胞的凋亡誘導作用。

圖4 CDDP、SCU 及SCU 聯合CDDP 對4T1 腫瘤細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of CDDP,SCU and SCU+CDDP on apoptosis of 4T1 cells

2.4 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響

為了進一步驗證SCU 對CDDP 抗4T1 腫瘤細胞的增敏作用，接下來，在體內水平考察了SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的作用。結果如圖5 所示，在接種腫瘤17 d 后，與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組腫瘤平均體積分別減少了31.9%和36.6%，差異具有極顯著意義（P＜0.01）。而SCU+CDDP 聯合用藥組腫瘤平均體積減少的更多，減少了49.7%，與SCU 組及CDDP 組比較差異具有顯著意義（P＜0.05），提示兩藥聯合應用能夠顯著抑制4T1 細胞體內的生長作用。同時，整個給藥期間，各給藥組均未引起小鼠體重明顯的下降（圖5A）。提示SCU 聯合CDDP 在抑制4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的同時并未引起明顯的毒性。

圖5 SCU 聯合CDDP 對B16 荷瘤小鼠腫瘤體積和體重的影響Fig.5 Effect of SCU+CDDP on tumor volume and weight of 4T1-bearing mice

實驗結束后處死小鼠并剝離腫瘤組織稱重，如圖6 所示，空白對照組、60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組以及SCU+CDDP 給藥組的瘤重分別為1.17±0.21、0.42±0.13、0.34±0.24 和0.16±0.15 g。與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP組瘤重分別減少64.2%與70.5%，具有極顯著性差異（P＜0.01）；SCU+CDDP 組瘤重減少86.2%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。由以上結果可知，SCU 能夠增強CDDP 對4T1 在體腫瘤的抑制作用。

圖6 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Fig.6 Effect of the combination of SCU and CDDP on the growth of 4T1 tumor from mice

2.5 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤細胞形態、腫瘤組織壞死的影響

接下來，通過H&E 染色觀察SCU 聯合CDDP對腫瘤細胞形態和腫瘤組織壞死的影響。首先觀察腫瘤異型性，結果如圖7 所示：各組腫瘤細胞排列紊亂，層次多，失去方向性；腫瘤細胞大小不一，形態各異，細胞核大小、形態及染色不一，核質比例失調，病理性核分裂多見，呈不對稱性、多極性分裂，腫瘤異型性高。

圖7 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤血管密度的影響Fig.7 Effect of the combination of SCU and CDDP on the micro-vessel density in 4T1 tumor tissue

觀察腫瘤組織壞死及腫瘤間質情況，對照組腫瘤組織核深染色，腫瘤細胞密度減少，可見核固縮、破碎，胞漿外溢，可見片狀壞死區域及大量微血管；60 mg/kg SCU 組及3.0 mg/kg CDDP 組腫瘤組織核深染，少見凋亡形態學改變，少見核固縮及部分微血管；而SCU 聯合CDDP 組腫瘤組織核深染，少見凋亡形態學改變，少見核固縮并且幾乎無血管。對各組血管密度進行分析，可知SCU 聯合CDDP 能夠抑制腫瘤微血管的形成，從而抑制在體腫瘤4T1 的生長（P＜0.01）。

2.6 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子表達的影響

Bcl家族是重要的凋亡相關基因，在惡性腫瘤發生發展中扮演著重要的角色，其中Bcl-2是阻止細胞凋亡的相關基因，而Bax是促進細胞凋亡的相關基因[28-29]。Caspase 家族是一組半胱氨酸蛋白酶，在介導細胞凋亡過程中起到重要作用，其中以Caspase-3 與Caspase-9 最為關鍵，其激活是細胞凋亡的特異性標志[30-31]。為進一步探討SCU 聯合CDDP 抑制4T1 在體腫瘤發生及生長的可能機制，本文采用實時熒光定量PCR 法檢測腫瘤組織中凋亡相關因子的表達，進一步探討SCU 聯合CDDP 對腫瘤細胞凋亡的影響。

通過實時熒光定量PCR 法檢測各給藥組對4T1 腫瘤組織中細胞線粒體凋亡通路因子的表達變化。結果如圖8 所示，與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Caspase-3與Caspase-9表達均上調，其中Caspase-3分別增加35.5%、57%及121%，具有極顯著性差異（P＜0.01），而Caspase-9分別增加42.3%、75.8%及129.5%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。與SCU 或CDDP 單用組相比，聯合組（SCU+CDDP）Caspase-3和Caspase-9mRNA 表達水平明顯增加，差異具極顯著性（P＜0.01）。

圖8 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子mRNA 水平的影響Fig.8 Effect of the combination of SCU and CDDP on the mRNA levels of apoptotic factors in 4T1 tumor tissue

與此同時，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Bax表達也較空白對照組明顯上調，分別增加23.2%、27.3%及88.5%，差異具有極顯著性意義（P＜0.01）。且與SCU 或CDDP單藥組相比，SCU+CDDP 聯合組的Bax水平上調更明顯，差異具有極顯著性（P＜0.01）；抗凋亡蛋白Bcl-2的mRNA 表達則正好相反。與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP組腫瘤組織中的Bcl-2表達均下調，分別減少27.3%、33.3%及52.7%，具有極顯著性差異（P＜0.01）。且SCU+CDDP 聯合組的Bcl-2水平較SCU 和CDDP單藥組極顯著下調（P＜0.01）。

通過Western Blot 在蛋白水平上考察各給藥組對4T1 腫瘤組織凋亡相關蛋白表達的影響。結果如圖9 所示，與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Cspase-9 以及Cleaved-Caspase-9 蛋白表達均極顯著上調（P＜0.01）。其中，SCU+CDDP 聯用組Caspase-3 的表達較SCU 單用組顯著上調（P＜0.05）；Cleaved-Caspase-3、Cspase-9 以及Cleaved-Caspase-9 蛋白表達均極顯著上調（P＜0.01）。與此同時，60 mg/kg SCU 組、3.0 mg/kg CDDP 組及SCU+CDDP 組腫瘤組織中的凋亡蛋白Bax 的表達也較空白對照組極顯著上調（P＜0.01），且聯用組較CDDP 單用組Bax 的上調更明顯，差異具有極顯著性（P＜0.01）。60 mg/kg SCU、3.0 mg/kg CDDP 及SCU+CDDP 處理均導致抗凋亡蛋白Bcl-2 表達顯著下調（P＜0.05），且聯用組較SCU 或CDDP單用組下調更明顯，差異具顯著意義（P＜0.05）。

圖9 SCU 聯合CDDP 對4T1 荷瘤小鼠腫瘤組織中凋亡因子蛋白表達的影響Fig.9 Effect of the combination of SCU and CDDP on the expression of apoptotic proteins in 4T1 tumor tissue

以上結果證實了SCU 聯合CDDP 可通過降低腫瘤細胞線粒體通路凋亡因子Bcl-2/Bax 比例進而促進腫瘤細胞凋亡，由此有可能進一步影響到腫瘤的發生和生長的過程。

3 結論

本實驗對SCU 聯合CDDP 的抗乳腺癌作用進行了體內外探究，通過體外細胞實驗發現，SCU 聯合CDDP 對乳腺癌的抑制作用明顯優于單藥。CCK-8實驗證實與單獨使用200 μmol/L 的SCU 及80 μmol/L的CDDP 相比，兩者聯合可顯著抑制4T1 細胞的增殖（P＜0.01）；細胞劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗也進一步證實SCU 與CDDP 聯合用藥組較空白對照組和單藥組能極顯著抑制4T1 細胞的遷移和侵襲能力（P＜0.01）；流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，與對照組和單藥組相比，聯合用藥組的4T1 細胞凋亡率最高。

體內移植瘤實驗結果表明，SCU 聯合CDDP 用藥可明顯抑制4T1 腫瘤生長，與空白對照組相比，60 mg/kg SCU 組與3.0 mg/kg CDDP 組瘤重分別減少64.2%與70.5%，SCU 聯合CDDP 組瘤重減少86.2%。同時SCU 聯合CDDP 組還可顯著降低腫瘤組織的微血管密度（P＜0.01），證實SCU 在體內水平也具有抗乳腺癌的作用。通過實時熒光定量PCR法以及Western Blot 法檢測腫瘤組織中凋亡相關因子的基因及蛋白表達發現，SCU 及CDDP 單藥組作用后，抗凋亡蛋白Bcl-2 水平均下調，而促凋亡蛋白Bax 水平明顯上調，Caspase-3 及Caspase-9 表達水平均增高，這一結果在SCU 聯合CDDP 用藥組更為顯著，提示SCU 能夠促進CDDP 乳腺癌4T1 細胞凋亡誘導作用。

綜上所述，本研究表明SCU 體內外均具有抑制4T1 腫瘤的生長的作用，這一作用不僅與其體外直接抑制腫瘤細胞增殖、遷移侵襲能力及促進細胞凋亡有關，也與其抑制腫瘤微血管密度、激活凋亡因子通路促進細胞凋亡密切相關。本次研究僅僅是從體內外實驗的角度初步研究了SCU 對4T1 腫瘤生長的抑制作用，后續還需要對具體的作用機制進行更為深入的研究和驗證，以便全面、準確地掌握SCU 的藥理作用規律，提高腫瘤治療效果并減少不良反應。