基于GEO基因芯片聯合網絡藥理學及分子對接技術探討參苓脾喜湯治療慢性胃炎、胃黏膜上皮內瘤變、胃早期癌作用機制

張玉佩，唐偉，2

1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230000；2.安徽中醫藥大學附屬六安市中醫院，安徽 六安 237000

胃黏膜上皮內瘤變（gastric intraepithelial neoplasia，GIN）是一種以細胞形態和組織結構與其起源的正常胃黏膜組織存在不同程度不典型性為特征的病理學改變，屬于胃癌前病變，相當于胃黏膜異型增生[1-2]。研究表明，GIN 與膽汁逆流、幽門螺桿菌（Hp）感染、飲食因素、免疫紊亂及患者年齡等因素有關[3-4]。GIN作為胃癌的癌前病變，其診斷及治療是防控胃癌的關鍵，也是胃癌二級預防的重點[1]。胃早期癌（early gastric cancer，EGC）指癌組織僅局限于黏膜層及黏膜下層，不論是否有區域性淋巴結轉移。EGC患者手術（或內鏡下切除）后5年生存率可達90%～95%[5]。但EGC多無典型臨床癥狀，大多數患者就診時已處于中晚期。Correa等[6-7]提出腸型胃癌的過程為“正常胃黏膜→慢性炎癥→萎縮性胃炎→腸化生→GIN→EGC→進展期胃癌（Correa模式）”。GIN和EGC處于Correa模式的中間階段，早期識別并盡早有效干預，可有效提高患者生存質量、改善預后。

參苓脾喜湯為唐偉教授在經典名方參苓白術散基礎上化裁而成，其用于慢性胃炎（chronic gastritis，CG）、GIN及EGC的輔助治療療效較好。目前關于參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC的藥效物質基礎和分子機制尚不明確。本研究通過網絡藥理學及分子對接技術篩選CG、GIN、EGC轉化的關鍵差異基因及靶點，從而闡明參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC炎癌轉變的潛在作用機制，以更好地發揮中醫藥治療GIN及EGC的作用，為后續相關研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 疾病靶點獲取

在GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）數據庫中檢索“Early-stage gastric cancer”，篩選同時含有CG、GIN、EGC 患者的樣本，轉錄組芯片數據集GSE130823符合要求，獲取該芯片表達矩陣文件。其中，CG、GIN、EGC分別納入47個、31個（胃低級別上皮瘤變17個、胃高級別上皮瘤變14個）、16個單樣本數據。應用R4.1.1 limma包計算CG、GIN及EGC之間的差異表達基因，篩選標準為P＜0.05、|log2FC|＞1.0，P＜0.05 的基因中，若log2FC＞1.0，則為上調基因，log2FC＜-1.0，則為下調基因，將處理后數據導入R4.1.1繪制火山圖。

1.2 參苓脾喜湯活性成分及靶點獲取

在TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）數據庫中檢索黨參、茯苓、白術、陳皮、蓮子肉、山藥、紫蘇梗、砂仁、豆蔻、薏苡仁、麥芽的活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件進行篩選，通過以上數據庫獲取活性成分作用靶點。

1.3 交集靶點篩選及蛋白相互作用網絡構建

使用R4.1.1 ggvenn 包將藥物作用靶點、CG、GIN、EGC 疾病靶點和差異表達基因取交集，導入STRING（https://cn.string-db.org/）數據庫進行分析，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，隱藏無關靶點，其他參數保持默認設置。利用Cytoscape3.9.1軟件繪制交集靶點蛋白相互作用（PPI）網絡，利用CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，以度中心性為2倍中位值，介度中心性、接近中心性、特征向量中心性、局部邊連通性均大于中位值，篩選核心靶點。

1.4 GO功能和KEGG通路富集分析

利用R4.1.1的cluster profiler R包及Perl語言對所得基因進行GO分析，包括細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物過程（BP）。利用cluster profiler R包進行KEGG通路富集分析，選取P≤0.05的分析結果進行可視化，并選取GO中BP、CC、MF排名前10位條目及KEGG中排名前30位通路繪制柱狀圖。

1.5 分子對接驗證

在PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫下載參苓脾喜湯中藥活性成分結構式，在PDB（https://www.rcsb.org/）數據庫下載核心蛋白結構。采用PyMOL1.8.0軟件對蛋白質進行去水、去磷酸根等操作，利用AutoDock Tools 1.5.7軟件將活性成分與核心蛋白基因文件轉換為pdbqt格式并尋找活性口袋，通過Vina插件進行分子對接，將輸出的分子對接結果導入PyMOL軟件以顯示分子對接結構。結合能＜0 kcal/mol說明配體與受體可自發結合，結合能≤-5.0 kcal/mol及LibDockScore＞100表明兩者可穩定對接。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選

在GSE130823數據集中篩選出1 115個差異表達基因，見圖1，其中上調基因502個、下調基因613個。

圖1 GSE130823數據集中CG、GIN、EGC差異表達基因火山圖

2.2 參苓脾喜湯活性成分及靶點

篩選出參苓脾喜湯活性成分138種，其中、白術7種、陳皮5種、黨參21種、豆蔻12種、茯苓15種、蓮子肉11種、麥芽18種、山藥16種、砂仁10種、薏苡仁9種、紫蘇14種，去重后得到119種活性成分。經STRING數據庫標準化后得到對應靶點247個。

2.3 中藥-活性成分-靶點網絡構建

利用Cytoscape3.9.1軟件構建中藥-活性成分-靶點網絡，該網絡共有60個節點、159條邊，見圖2。共得到參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC潛在靶點22個，包括CHRM3、AR、ADRB2、DPP4、MTTP、NOS2、EPHB2、 ADRA2A、 SLC6A2、 XDH、 SLC2A4、MMP3、 FOS、 CYP3A4、 PTGER3、 DUOX2、NR1I2、CLDN4、GSTM2、DRD2、DRD5、ALB。網絡拓撲分析顯示，度值排名前3位的活性成分依次是槲皮素、豆甾醇、木犀草素。

圖2 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC中藥-活性成分-靶點網絡

2.4 蛋白相互作用網絡構建

利用Cytoscape3.9.1軟件構建交集靶點PPI網絡，包含19個節點、54條邊。利用CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，得到節點平均度值為5.68，介度中心性為0.079 8。以關聯蛋白線條目≥12為核心靶點。篩選后得到ALB、AR、DPP4、CYP3A4共4個核心靶點，見圖3。

2.5 GO功能和KEGG富集分析結果

將22個交集靶點導入R4.1.1進行分析，得到269個GO 條目（見圖4）和30 條KEGG 通路（見圖5）。BP主要涉及腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、對外源性刺激的反應、離子跨膜轉運蛋白活性的調節、腺苷酸環化酶調節G蛋白偶聯受體信號通路等；CC主要涉及肌漿網、肌漿、細胞基膜、細胞基部等；MF主要涉及兒茶酚胺結合、G蛋白偶聯胺受體活性、突觸后神經遞質受體活性等。KEGG通路富集主要涉及化學致癌作用-受體激活、cAMP、神經活性配體-受體相互作用、鈣信號通路、IL-17、TNF等信號通路。

圖4 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC靶點GO功能富集分析

圖5 參苓脾喜湯治療CG、GIN、EGC靶點KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗證

根據網絡藥理學聯合生物信息分析結果，將參苓脾喜湯中核心活性成分槲皮素、木犀草素、豆甾醇與核心靶點蛋白ALB、AR、DPP4 進行分子對接驗證（見表1、圖6）。結合能≤-7 kcal/mol表明結合良好，可見木犀草素與ALB、AR、DPP4對接良好，槲皮素與ALB、DPP4對接良好，豆甾醇與AR對接良好。

表1 參苓脾喜湯核心活性成分與CG、GIN、EGC核心靶點分子對接結果

圖6 參苓脾喜湯核心活性成分與CG、GIN、EGC核心靶點分子對接示意

3 討論

目前對于EGC及GIN的治療，西醫主要使用根除Hp的三/四聯療法，運用葉酸與抗氧化劑、環氧化酶2抑制劑、抗膽汁反流等治療藥物及進行內鏡下黏膜剝離術（內鏡下黏膜切除術），容易引起機體耐藥性[8]。中醫對于CG、GIN、EGC的治療注重未病先防和既病防變，而復方中藥具有多成分、多靶點、多層次的作用特點，能有效調節CG、GIN、EGC病變微環境，改善臨床癥狀，干預胃黏膜病理改變，在一定程度上改善CG的異型增生和癌變趨勢[9]。參苓脾喜湯是在參苓白術散的基礎上以黨參代替人參，加大茯苓、白術的用量，去桔梗、白扁豆和甘草，加紫蘇梗、陳皮、麥芽、豆蔻加減化裁而成。本方以健脾化濕為主，兼以理氣醒脾和胃。中醫學中無“胃上皮瘤變”病名，因其多伴胃脘脹滿、疼痛、納呆等癥，故屬“胃脘痛”“痞滿”范疇。GIN和EGC以脾胃虛弱為本，氣滯、濕熱、血瘀、癌毒等病理因素為標，而氣滯濕阻是GIN初期常見病機[10]，參苓脾喜湯能有效截斷CG、GIN、EGC病機變化，以阻斷胃黏膜癌變趨勢。

從分子對接結果來看，參苓脾喜湯排名前3位的活性成分與排名前3位的核心靶點均能有效對接。其中木犀草素與ALB、AR、DPP4對接良好，槲皮素與ALB、DPP4對接良好，豆甾醇與AR對接良好。槲皮素能抗癌、抗炎及抗氧化和清除自由基。祝珊珊等[11]研究表明，槲皮素能通過抑制人胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導其凋亡，調節p-PI3K和Bcl-2蛋白表達，起到抗胃癌細胞活性的作用；喻春紅等[12]研究表明，槲皮素通過抑制干擾素調節因子-8/人干擾素-γ軸，降低胃部炎癥反應，增強其胃分泌功能，從而改善Hp感染誘導的慢性萎縮性胃炎。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗菌功效，研究表明，其可通過EGFR、STAT3等通路抑制癌細胞的增殖轉化，誘導癌細胞凋亡，從而發揮抗腫瘤的作用，還可通過HIF-1α、JAK/STAT等通路抗胃癌細胞增殖和遷移、誘導胃癌細胞凋亡[13-14]。豆甾醇具有抗炎、抗腫瘤等生物活性[15-16]，其可抑制炎癥模型中炎癥因子白細胞介素（IL）-1β 和腫瘤壞死因子（TNF）-α 的水平，可能通過調節MAPK3 和cAMP/PRKACA等信號通路調控炎癥細胞因子水平，從而發揮抗炎作用[17]，這與KEGG富集分析結果一致。

PPI網絡結果顯示，ALB、AR、DPP4、CYP3A4在炎癌轉化過程中發揮了關鍵作用。ALB是編碼白蛋白的基因，其可增強腫瘤特異性，降低藥物誘導的細胞毒性，并在較長時間內保持治療活性劑如藥物濃度[18]。ALB與全身炎癥反應和營養狀況密切相關，參與清除自由基、維持膠體滲透壓[19]。AR基因編碼雄激素受體，是雄激素作用的關鍵基因，與多種癌癥關系密切。研究表明，AR可通過刺激CCRK的表達，促進GSK3β和β-catenin磷酸化、EGFR表達及胃癌細胞的遷移、侵襲和增殖，從而促進胃癌的發生與發展，該基因在食管鱗癌上皮內瘤變中呈陽性表達，且表達隨異性程度加重而增加[20-21]。DPP4是一種膜結構蛋白酶，可調節糖代謝、胰島素分泌、胃腸動力學等。實驗發現，DPP4抑制劑可減少腸道炎癥并改善葡萄糖代謝，其可通過CXCR4 刺激誘導胃癌細胞惡化[22-23]。CYP3A4是人體內一種重要的細胞色素P450酶，主要在肝臟中表達，參與藥物代謝和許多內源性化合物代謝。研究發現，CYP3A4的表達可能與慢性萎縮性胃炎向胃癌的潛在致癌轉化有關[24]。

從KEGG 富集分析結果來看，參苓脾喜湯防治CG、GIN、EGC 病變主要涉及細胞增殖、分化與凋亡，炎癥及免疫反應通路。較為顯著的信號通路有cAMP、鈣信號通路、IL-17、TNF等。cAMP信號通路是一種重要的細胞內信號傳遞機制，參與調控代謝、細胞增殖和凋亡、細胞信號轉導、免疫應答等多種生物學過程。異常的cAMP/PKA信號傳導與各種類型的人類腫瘤有關，可能同時具有腫瘤抑制和腫瘤促進作用。研究表明，cAMP升高和PKC下調可誘導胃癌細胞凋亡，抑制胃癌細胞增殖，從而抑制胃癌進展[25-26]。鈣信號通路參與真核細胞跨膜信號轉導途徑，對細胞的生存與凋亡起著重要調控作用。研究發現，鈣信號通路能介導胃癌細胞凋亡、促進損傷胃上皮細胞遷移和修復[27]。TNF是由單核巨噬細胞、淋巴細胞產生的細胞毒因子，可介導炎性反應、免疫、細胞凋亡或存活等生物過程，包括TNF-α、TNF-β 等。研究發現，TNF-α在慢性炎性反應介導胃癌發生的過程中發揮重要作用，且可參與胃癌發生，癌細胞增殖、侵襲和轉移，及新生血管形成、上皮間質轉化等多個病理過程[28]。IL-17是一類主要由活化CD4+淋巴細胞產生的具有促炎作用的細胞因子，可分泌炎性和造血性細胞因子，也與自身免疫和腫瘤發生發展密切相關，胃癌患者血清IL-17明顯升高，且隨著病情進展持續升高[29]。

綜上所述，參苓脾喜湯可通過槲皮素、豆甾醇、木犀草素等成分作用于ALB、AR、DPP4、CYP3A4等基因，調控cAMP、IL-17、TNF、鈣信號通路等抑制胃癌細胞的增殖與遷移、誘導胃癌細胞凋亡、抑制炎癥反應，以防治CG、GIN、EGC 病變。研究顯示，CG、GIN、EGC的發病、轉歸受多個靶點、通路共同影響，且參苓脾喜湯阻斷CG、GIN、EGC病變優勢顯著。本研究可為中藥復方防治EGC提供參考依據，但仍存在不足之處，需要動物實驗和臨床研究予以驗證。