植物病原細菌基因敲除技術在本科開放實驗中的設計與實踐

李開懷，劉鳳權

（貴州大學農學院植物病理學教研室 貴州 貴陽 550025）

植物病害是農業生產中的重要問題，給農作物的生長和豐產帶來了嚴重的威脅[1-2]。隨著科學技術的不斷發展，分子生物學技術在植物病理學研究中的應用日漸增多。其中，基因敲除技術作為一種有效的工具，幫助科學家們揭示植物病原細菌對宿主的致病機制，從而為病害的防控提供新思路和策略[3]。然而，在傳統的本科生實驗教學中，過于重視理論，而忽視實踐操作的重要性，限制了學生對分子生物學技術的深入理解和應用能力的培養[4]。因此，本文設計并實施了一種植物病原細菌基因敲除技術的本科開放實驗，旨在提供實際科研體驗，以培養學生的批判性思維和創新能力。

我們希望通過本次開放性實驗的研究，有效地激發學生對植物病理學研究的興趣，培養他們的科學探究精神和實踐能力，為他們未來從事相關領域的研究工作奠定堅實基礎。同時，本實驗也有助于提高學生的綜合素質，培養創新意識和團隊合作精神，為他們的職業發展打下良好的基礎。隨著分子生物學技術的不斷進步和應用范圍的擴大，本研究所采用的基因敲除技術在植物病原細菌研究中的教育意義和科學價值將得到充分的顯現，對于推動植物病理學教育改革、培養未來科研人才具有重要意義。

隨著科學技術的迅猛發展，教育領域也越來越重視創新教學方法與教學內容的設計與實踐。本實驗教學以野油菜黃單胞菌rpoN2 基因突變菌株構建為實驗目標[5]，探討利用植物病原細菌基因敲除技術作為本科開放實驗的教學內容，培養學生的科學研究能力、實驗操作技巧和團隊合作精神，進一步推動本科教學改革的發展。本開放性實驗的基本方法和經驗，可為“植物病理學”“分子生物學”“農業微生物學”等實驗課程的教育教學提供參考[4-6]。

1 課程內容設計

教師深入淺出地講解基因敲除技術的原理及其在植物病原細菌研究中的應用，幫助學生明白其重要性。接著，教師詳細闡述基因敲除實驗的各個步驟，包括細菌DNA的提取、敲除載體的構建、細菌的轉化以及陽性克隆的篩選等。隨后，學生進行實驗前的準備工作，如整理實驗材料、檢查實驗設備等，接著按照指南完成實驗，并記錄實驗數據和觀察結果。最后，教師引領學生進行實驗數據的統計分析和結果解讀，鼓勵學生以口頭或書面報告的方式將實驗結果分享給其他學生和教師。本次實驗旨在讓學生掌握基因敲除技術的原理和操作步驟，熟練使用相關設備和材料；指導學生收集和整理實驗數據，進行分析和解讀；促進團隊協作，共同完成實驗任務；并通過實踐，激發學生對科學問題的好奇心和求知欲。

本次開放實驗共包括五次實驗操作及一次總結匯報，每次實驗時間為2 至6 小時，總計18 學時。學生分為10個小組，每組3 人。具體教學課程的內容安排人如下：

第一課、提取細菌基因組DNA：課時2 小時，過夜培養野油菜黃單胞菌至OD600≈1.0，取野油菜黃單胞菌培養液3mL，離心收集菌體，根據細菌基因組DNA 提取試劑盒的方法指示，提取野油菜黃單胞菌基因組DNA，最后通過瓊脂糖電泳檢測DNA 的完整性和濃度，保存于-20°C 冰箱，以便后續用于構建rpoN2 基因敲除載體。

第二課、基因敲除質粒的構建：課時6小時，設計rpoN2基因敲除相關引物，以野油菜黃單胞菌基因組DNA 為模板，PCR 擴增獲得rpoN2 基因上下游約500 bp DNA 片段，進一步以rpoN2 上下游DNA 片段為模板，通過重疊延伸PCR 擴增，獲得rpoN2 基因敲除盒片段，通過雙酶切消化后，與載體pK18mobsacB 進行連接，將連接產物轉化DH5 ，涂布于含50 g/mL 卡拉霉素的LB 平板，培養1 天后獲得轉化子，通過菌落PCR篩選和基因測序，獲得rpoN2基因敲除自殺性質粒pK18-rpoN2。

第三課和第四課、一次重組菌株的篩選：課時4 小時，將構建的rpoN2 基因敲除自殺性質粒pK18-rpoN2 通過電激轉化導入野油菜黃單胞菌中。將轉化子涂布于含50 g/mL卡拉霉素和30 g/mL 利福平的NYG 雙抗平板，培養4 天后獲得單克隆，通過平板劃線篩選具有卡拉霉素和利福平抗性的單克隆，對具有卡拉霉素抗性的菌株進行菌落PCR篩選，獲得一次重組菌株。

第五課、突變體菌株的篩選：課時2 小時，將一次重組菌株在無卡拉霉素的NYG 中培養后，涂布于含有15%蔗糖的篩選平板上，培養4 天后獲得單克隆，通過平板劃線篩選卡拉霉素丟失的單克隆菌株，然后通過大量菌落PCR篩選，獲得rpoN2 基因突變體菌株。

第六課、總結匯報：課時4 小時，在實驗結束后，學生進行一次總結報告，匯報植物病原細菌基因敲除的原理，對實驗結果進行解釋和討論，以及對實驗過程的反思和評估。邀請專業教師對學生實驗操作的規范性，數據分析的準確性進行點評，分析學生在本次開放性實驗中的優點和不足。

2 實驗教學成效

本次開放實驗將基因組DNA 提取、基因敲除質粒構建、細菌遺傳轉化、菌落PCR 篩選陽性菌株等步驟有機地整合到一起，形成了一個完整的實驗流程，使學生能全方位地完成一個科學實驗。通過親身參與操作，學生不僅掌握了細菌基因敲除技術的原理，更激發了他們對科學研究的熱愛與好奇心。這樣的開放實驗無疑是一個適合在植物保護專業和生物學專業的本科生之間推廣的實驗教學課程，具體表現在以下幾個方面：

2.1 深化學生對植物病原細菌基因敲除技術的理解

在本次實驗課中，通過教師詳細講解了植物病原細菌基因敲除技術的原理和實驗步驟，以及學生的實際操作，增強了學生對植物病原細菌基因敲除技術的理解。

2.2 提升學生實驗的動手能力和結果的分析能力

本次實驗課使學生有機會親自參與并完成植物病原細菌基因敲除相關的實驗操作，通過這樣的親身實踐，有效提高了他們的動手能力。同時，在實驗過程中，學生需要觀察、記錄實驗現象，并對實驗結果進行分析和解釋，這無疑也鍛煉和提高了學生的數據分析能力。

2.3 促進跨學科的技術融合

本次實驗課程融合了植物保護學的專業知識和生物學的基礎理論和技術。使植物保護專業和生物學專業的本科生有機會從不同的視角和層次了解和掌握這一技術，從而拓寬他們的知識視野，提升他們的綜合素質。

2.4 培養學生的科研素養和團隊協作能力

在實驗過程中，學生需要學會如何設計實驗方案，如何調整和控制實驗條件，以及如何處理和解決實驗中可能出現的問題。這不僅可以培養他們的科研素養，同時也能鍛煉他們解決問題的能力。此外，實驗往往需要多人協作完成，因此，本次實驗課程也有助于提高學生的團隊協作能力和溝通交流能力。

2.5 激發學生對科學研究的熱情和興趣

本次實驗課程以植物病原細菌基因敲除技術為主題，是一個既具有理論性又具有實踐性的科學研究課題。通過自己動手做實驗，學生可以直接參與到科學研究中來，體驗科學研究的樂趣和魅力，從而激發他們對科學研究的熱情和興趣。

2.6 有利于在本科教學實驗中推廣學習

本次實驗課設計的植物病原細菌基因敲除技術實驗具有很強的實踐性和操作性，非常適合在本科教學實驗中推廣和應用。通過本實驗課程，學生能夠更好地掌握植物病原細菌基因敲除技術的實驗方法，以及如何分析和解讀實驗結果，為他們未來的學習和研究工作打下堅實的基礎。

3 教學總結

本次開放實驗課程鼓勵學生將實驗結果與植物病原細菌基因敲除技術的實際應用相結合，探索其在農業和環境領域的潛在價值。通過組織交流報告，邀請專業人士進行評審和指導，以激發學生的創新思維和科研能力。本次課程以植物病原細菌基因敲除技術為主題，從實驗目標與任務、實驗內容與步驟、實驗設備與配備、分組與協作學習、實驗指導與輔導、實驗評估與反饋，以及實驗結果的應用與展示等方面，提供了全方位的教學設計與實踐。實驗教學的結果表明，十個學生小組中，除第三小組未能成功構建野油菜黃單胞菌rpoN2 基因突變菌株外，其余九個小組均取得了預期的實驗結果。從學生的實驗總結和PPT 報告來看，他們已經掌握了植物病原細菌基因敲除技術的基本原理，并對各個實驗環節有了較深入的理解。綜合考慮，這樣的教學內容有助于培養學生的科學研究能力、操作技巧和團隊協作精神，為他們未來從事植物病原細菌相關的科研工作打下了堅實的基礎。