姜黃素抑制巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸潤(rùn)的機(jī)制研究

楊耿華 葉沃權(quán) 何樹榮 何偉平

肩袖撕裂作為臨床中較為常見的一種疾病，該疾病主要表現(xiàn)為會(huì)引起患者的肩關(guān)節(jié)出現(xiàn)疼痛、乏力和功能障礙等臨床癥狀的發(fā)生[1]。肩袖撕裂疾病在發(fā)病的早期可以優(yōu)先采取保守治療方式，若保守治療無(wú)效后再采取關(guān)節(jié)鏡下肩袖修補(bǔ)手術(shù)治療。針對(duì)肩袖撕裂情況不嚴(yán)重的患者，早期的關(guān)節(jié)鏡下肩袖修補(bǔ)手術(shù)治療就能夠取得較為顯著的治療效果[2]。但是該治療方式對(duì)于肩袖撕裂嚴(yán)重的情況，修補(bǔ)手術(shù)并不能滿足患者的病情需求且效果較差。我國(guó)中醫(yī)骨傷科將肩袖撕裂歸屬于“慢性筋骨病”范疇，針對(duì)該疾病“氣虛血瘀，本虛標(biāo)實(shí)”的特征，基于中醫(yī)外科內(nèi)治法-托法治療原則，運(yùn)用適合的中醫(yī)療法進(jìn)行正確的干預(yù)和預(yù)防，對(duì)該疾病的治療取得了較好的治療效果[3-4]。基于此，本研究主要是分析在巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸潤(rùn)的治療中，在托法原則的基礎(chǔ)上姜黃素靶向內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族含熱蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3，NLRP3）/ 炎癥小體炎癥因子白細(xì)胞介素1β（recombinant human interleukin-1β，IL-1β）炎性通路的抑制作用及機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

本次研究主要分為2 個(gè)研究階段，即第一階段（2021年7月—2022年7月）和第二階段（2022年8月—2023年7月），其中第一階段期間首先通過(guò)對(duì)姜黃素復(fù)合物進(jìn)行制備，并做好相應(yīng)的準(zhǔn)備工作，再開啟第二階段研究計(jì)劃；第二階段通過(guò)構(gòu)建30 只大鼠肩關(guān)節(jié)慢性巨大肩袖撕裂模型，模型大鼠為無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量250 ～300 g。研究采用的30只大鼠均在研究前于溫度為20℃～22℃恒溫動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，溫度控制在（60±10）%，每間隔12 h 進(jìn)行1 次光照與黑夜交替，大鼠正常自主進(jìn)食和飲水，于研究前均進(jìn)行造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 。構(gòu)建30 只大鼠肩關(guān)節(jié)慢性巨大肩袖撕裂模型，并根據(jù)姜黃素給入的劑量不同將30 只大鼠模型分為3組，即普通膳食組、姜黃素混合膳食低劑量組、姜黃素混合膳食高劑量組，每組各有大鼠模型10 只。其中，普通膳食組中雄雌各5 只，雄（2.01±0.12）月齡，雌（2.50±0.09）月齡；體質(zhì)量約為：雄（360.57±59.84）g，雌（250.12±137.59）g；姜黃素混合膳食低劑量組中雄性大鼠有6 只、雌性大鼠有4 只，雄（2.12±0.11）月齡，雌（2.38±0.10）月齡；體質(zhì)量約為：雄（361.20±58.26）g，雌（250.74±138.03）g；姜黃素混合膳食高劑量組中雄性大鼠有7 只、雌性大鼠有3 只，雄（2.11±0.12）月齡，雌（2.40±0.10）月齡；體質(zhì)量約為：雄（362.19±58.34）g，雌（251.07±139.01）g。3組大鼠模型的雄雌性別、月齡以及體質(zhì)量對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 利用800 mg 透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）（1 000 ～1 500 kDa）溶于1：1 V/V（H2O/DMSO）混合物80 g，加入100 mg 二環(huán)己基碳二亞胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）和二甲氨基（4-dimethylaminopyridine，DMAP）；攪拌1 h將溶液與75 mg 姜黃素溶解；在65°C 下放置約6 h；溶液用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）透析1 d，然后去離子水透析放置3 d；制成的HA-姜黃素復(fù)合物脫水后在4℃保存。姜黃素復(fù)合物溶于磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer salt solution，PBS）后除菌過(guò)濾可直接作用于細(xì)胞。

1.2.2 造模與給藥 （1）大鼠稱重麻醉后鎮(zhèn)痛，肩關(guān)節(jié)備皮消毒鋪巾，暴露岡上肌、岡下肌穿線標(biāo)記，直視切斷后沖洗傷口，逐層關(guān)閉傷口；術(shù)后予青霉素預(yù)防感染，并予以鎮(zhèn)痛；術(shù)后3 d 大鼠完全恢復(fù)后開始進(jìn)行3組膳食喂養(yǎng)；普通膳食組大鼠采取正常飼養(yǎng)、姜黃素混合膳食低劑量組在正常飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上每天注射，姜黃素100 mg/（kg·d）；姜黃素混合膳食高劑量組在正常飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上每天注射姜黃素500 mg/（kg·d）；每2 天對(duì)大鼠的大體狀態(tài)進(jìn)行觀察，并記錄其體質(zhì)量的變化情況。（2）3組大鼠分別進(jìn)行喂養(yǎng)3個(gè)階段，即第2、3、4 周，每個(gè)喂養(yǎng)周期抽取部分大鼠模型進(jìn)行安樂死，從而獲取大鼠肩關(guān)節(jié)處組織，制備成相應(yīng)的肩關(guān)節(jié)標(biāo)本，比較3組大鼠模型的脂肪浸軟程度[5-6]。

1.2.3 炎癥因子指標(biāo)檢測(cè) 通過(guò)對(duì)3組大鼠模型的炎癥因子采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于檢測(cè)的炎癥因子含量根據(jù)試劑盒說(shuō)明書的要求進(jìn)行測(cè)定。ELISA 檢測(cè)NLRP3/IL-1β 分泌：取培養(yǎng)后上清加100 μL/孔檢測(cè)試劑到96孔酶標(biāo)板，4℃放置過(guò)夜；第2 天棄去上清，苯二甲酸丁二醇酯（butanediol ester of phthalate，PBST）洗滌3 次，每孔加入150 μL 1%生血清白蛋白（body surface area，BSA）37℃封閉1 h；PBST 洗滌3 次，每孔加入100 μL 不同倍比稀釋度的上清，并加入對(duì)照樣品，37℃孵育2 h；PBST 洗滌5次后，加入100μL稀釋后的辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h；PBST 洗滌5 次后，顯色劑顯色20 min，酶標(biāo)儀上讀取A405 吸光度[7-8]。

1.3 觀察指標(biāo)

通過(guò)對(duì)30 只大鼠肩關(guān)節(jié)慢性巨大肩袖撕裂模型分別進(jìn)行藥物干預(yù)后，獲取3組大鼠模型在第2、3、4 周的肩關(guān)節(jié)固定脫鈣組織切片，分別檢測(cè)3組大鼠模型的脂肪浸軟程度，從而對(duì)3組大鼠模型的肌脂肪浸潤(rùn)進(jìn)行有效評(píng)估；并對(duì)大鼠巨大肩袖撕裂肌肉組織中NLRP3、IL-1β 指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，探討姜黃素對(duì)巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸潤(rùn)的抑制作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠模型脂肪浸潤(rùn)的評(píng)估

3組大鼠模型在正常情況下對(duì)比發(fā)現(xiàn)，姜黃素混合膳食高劑量組在第2 周以及第4 周的脂肪浸潤(rùn)情況明顯優(yōu)于普通膳食組和姜黃素混合膳食低劑量組（見表1），但經(jīng)過(guò)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示，3組數(shù)據(jù)結(jié)果Z=0.242，3組數(shù)據(jù)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 3組大鼠模型脂肪浸潤(rùn)（正常情況）的評(píng)估 [只（%）]

相比于普通膳食組而言，姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的脂肪浸潤(rùn)得到明顯的改善；姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的脂肪浸潤(rùn)評(píng)估類型中部分撕裂對(duì)脂肪浸潤(rùn)明顯的降低，大鼠模型脂肪逐漸趨于正常，但普通膳食組的脂肪浸潤(rùn)的部分撕裂顯示脂肪浸潤(rùn)更嚴(yán)重（見表2）。經(jīng)過(guò)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示，Z=2.879，3組數(shù)據(jù)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 3組大鼠模型脂肪浸潤(rùn)（部分撕裂情況）的評(píng)估 [只（%）]

相比于普通膳食組而言，姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的脂肪浸潤(rùn)得到明顯的改善；姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的脂肪浸潤(rùn)評(píng)估類型中完全撕裂對(duì)脂肪浸潤(rùn)明顯的降低，大鼠模型脂肪逐漸趨于正常，但普通膳食組的脂肪浸潤(rùn)的完全撕裂顯示脂肪浸潤(rùn)更嚴(yán)重（見表3）。經(jīng)過(guò)秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)顯示，Z=2.961，3組數(shù)據(jù)對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 3組大鼠模型脂肪浸潤(rùn)（完全撕裂情況）的評(píng)估 [只（%）]

表4 3組大鼠模型炎癥因子的檢測(cè)（pg/mL， ±s）

表4 3組大鼠模型炎癥因子的檢測(cè)（pg/mL， ±s）

注：與普通膳食組對(duì)比，P①＜0.05，P②＜0.05；與姜黃素混合膳食低劑量組相比，P①＜0.05，P②＜0.05。

組別NLRP3IL-1β普通膳食組（n=10）6.85±0.3644.33±2.83姜黃素混合膳食低劑量組（n=10）5.10±0.24①35.64±1.53①姜黃素混合膳食高劑量組（n=10）4.02±0.11②31.26 ±1.19②F 值12.7907.145 P 值0.0000.000

2.2 3組大鼠模型炎癥因子的檢測(cè)

相比于普通膳食組大鼠模型而言，姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的炎癥因子水平均明顯下降，且姜黃素混合膳食高劑量組下降的具有明顯的特征性；兩兩進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，普通膳食組與姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的炎癥因子對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；姜黃素混合膳食低劑量組與姜黃素混合膳食高劑量組的炎癥因子對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討論

作為我國(guó)中醫(yī)骨傷科疾病中較為常見的一種疾病，肩袖撕裂在中醫(yī)中主要屬于慢性筋骨疾病的一種，且針對(duì)該疾病若在臨床中不予以及時(shí)有效地治療，將會(huì)誘發(fā)患者的肩袖撕裂發(fā)展為巨大肩袖撕裂，最終形成關(guān)節(jié)炎，這對(duì)患者的日常生活和生活質(zhì)量水平都會(huì)造成嚴(yán)重的影響[9]。我國(guó)中醫(yī)對(duì)于慢性肌腱疾病的治療具有較為廣泛的研究，常以“氣血兼顧、筋骨并重”作為主要的治療指導(dǎo)方式，并將中醫(yī)外科內(nèi)治法-托法治療原則也運(yùn)用其中，通過(guò)該托法治療原則幫助肩袖撕裂疾病患者補(bǔ)益氣血或透膿扶助正氣、托毒外出[10]。針對(duì)慢性巨大肩袖撕裂疾病，主要的表現(xiàn)為撕裂部位炎癥持續(xù)、脂肪浸潤(rùn)，遂于此，該疾病特點(diǎn)也正好是托法治療的最佳適應(yīng)證。

炎性小體作為細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物會(huì)對(duì)微生物感染以及細(xì)胞損傷情況產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，這也就使得炎性小體具有受體識(shí)別的能力，因此目前該復(fù)合物也是作為炎性反應(yīng)的識(shí)別器。本次研究的NLRP3 是NLR 蛋白家族的一種，該炎性小體中NLRP3 經(jīng)常參與到人體疾病的全過(guò)程，因此臨床上對(duì)于NLRP3 的研究也較為廣泛。目前，對(duì)于NLRP3炎性小體而言，該炎性小體的激活性受眾面較廣，不僅局限于細(xì)菌毒素和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），還包括一系列的廣泛刺激物，如微生物等。當(dāng)NLRP3 炎性小體被刺激性激活后，該炎性小體會(huì)產(chǎn)生半胱氨酸蛋白酶-1（cysteine aspastic acid-specific protease 1，Caspase-1）， 該物質(zhì)能夠?qū)L-1β 從無(wú)活性轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨裕瑫r(shí)對(duì)于炎癥因子也具有較好的促進(jìn)性。而成熟后的IL-1β 作為促炎介質(zhì)，在需要免疫活動(dòng)中具有十分顯著的作用性。此外，炎癥小體也能夠被二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）刺激激活，同時(shí)能夠形成IL-1β 等炎癥因子，從而引發(fā)一系列的免疫反應(yīng)。

姜黃作為托法治療中最為常見的一種中草藥，該藥物不僅具有較好的抗炎效果，能夠?qū)γ庖呋钚赃M(jìn)行有效的調(diào)節(jié)，還能夠促進(jìn)患者的組織重新進(jìn)行生長(zhǎng)。有研究顯示[11]，NLRP3 炎性小體活化下的IL-1β 等炎癥因子下的檢測(cè)顯示，姜黃素可以在劑量方面依賴性地抑制細(xì)胞因子IL-1β成熟，并在成熟后進(jìn)行分泌。此外，姜黃素作為姜黃的提取物，其也具有抗炎、抗氧化的作用性；這也就使得該藥物能夠有效地阻斷NLRP3 炎性小體的活化，從而能夠有效地抑制Caspase-1 的剪切活化，從而達(dá)到對(duì)IL-1β 等炎癥因子的下調(diào)作用。本次研究顯示，姜黃素混合膳食低劑量組和姜黃素混合膳食高劑量組的炎癥因子水平均明顯下降，且姜黃素混合膳食高劑量組下降的具有明顯的特征性。說(shuō)明姜黃素能夠有效地降低肩袖撕裂炎癥情況，改善肩袖撕裂區(qū)域的微循環(huán)狀況。而NLRP3 炎癥小體能夠有效地識(shí)別多重誘導(dǎo)炎癥的刺激并激活I(lǐng)L-1β 的成熟及其他一些重要促炎因子的產(chǎn)生和釋放，最終使細(xì)胞能夠發(fā)生炎癥反應(yīng)，同時(shí)，姜黃素能夠減少骨骼肌炎性的損傷，降低炎性因子的水平，從而有效地抑制NLRP3/IL-1β 炎性通路與NLRP3 炎性體軸的激活，這也進(jìn)一步地提示姜黃素在針對(duì)大鼠肩袖撕裂的治療上具有較好的預(yù)防和干預(yù)效果[12]。

綜上所述，根據(jù)托法理論的治療原則，利用姜黃素治療巨大肩袖撕裂能夠有效地干預(yù)該疾病的脂肪浸潤(rùn)，這主要是由于姜黃素治療能夠通過(guò)對(duì)NLRP3 炎癥小體進(jìn)行有效的抑制，減少IL-1β 的生成，能夠通過(guò)NLRP3/IL-1β炎性通路抑制骨骼肌干細(xì)胞的脂肪分化，減少慢性過(guò)程中肌肉的脂肪浸潤(rùn)，從而改善肩袖肌腱肌肉的生物活力，因此，該治療方式為臨床肩袖撕裂保護(hù)治療提供新的選擇思路，為托法理論在肩袖疾病上創(chuàng)新運(yùn)用提供充分的基礎(chǔ)證據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景和較大的社會(huì)價(jià)值。