血清CCL18、TIMP-1、Apelin 表達(dá)與膝骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性

閆理想

（南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院，河南 南陽(yáng) 473000）

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（Knee osteoatthritis，KOA）作為臨床常見(jiàn)骨關(guān)節(jié)疾病，涉及關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨性生長(zhǎng)及滑膜異常，以疼痛、彈響、功能障礙等為主要臨床表現(xiàn)，是影響中老年人生存質(zhì)量及致殘的重要因素[1-2]。目前臨床尚無(wú)有效逆轉(zhuǎn)及阻斷KOA 進(jìn)展的治療手段，因此積極探討KOA 病因及發(fā)病機(jī)制對(duì)其防治是骨科亟待解決的重要問(wèn)題[3-4]。目前，KOA 早期診斷主要依靠影像學(xué)改變，但其缺乏特異性與敏感性，難以對(duì)KOA 病情變化作出有效診斷，延誤治療，因此從分子生物學(xué)角度尋求早期診斷并評(píng)估KOA 嚴(yán)重程度的標(biāo)志物對(duì)提高臨床診斷效能具有重要意義[5-6]。研究顯示，長(zhǎng)期慢性炎癥及損傷在KOA 發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[7]。CC 趨化因子配體18（CCchemokine ligand 18，CCL18）作為炎癥反應(yīng)過(guò)程中分泌的可溶性蛋白質(zhì)，其高表達(dá)狀態(tài)可誘導(dǎo)T 和B 淋巴細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，在關(guān)節(jié)侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物-1（Tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1，TIMP-1）作為可通過(guò)抑制MMPs 降解基質(zhì)蛋白質(zhì)，而膝骨關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程過(guò)量MMPs 釋放打破MMPs/TIMP 平衡，致使關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)被過(guò)度降解，引發(fā)軟骨系列退變表現(xiàn)[9]。

APJ 內(nèi)源性配體（Apelin）作為新型脂肪因子，其水平變化與糖尿病、高血壓及脂肪代謝紊亂等多種代謝綜合征存在密切關(guān)聯(lián)；而脂肪因子在肥胖KOA患者發(fā)生中發(fā)揮重要作用，并于KOA 嚴(yán)重程度相關(guān)，提示Apelin 可能在軟骨代謝中發(fā)揮作用，參與炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程[10]。

目前臨床對(duì)CCL18、TIMP-1、Apelin 在KOA 病變中的作用機(jī)制及與炎癥程度的相關(guān)性研究報(bào)道較少，為明確血清CCL18、TIMP-1、Apelin 在KOA 中的變化及與病情程度的相關(guān)性，本研究隨機(jī)選取本院74 例KOA 患者進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年10 月至2022 年10 月我院接收的膝骨關(guān)節(jié)炎患者74 例為研究組，男39 例、女35 例，年齡60.00±9.35 歲，病程4.50±3.83 y，BMI 指數(shù)24.77±2.59 kg·m-1，病變部位：左側(cè)39 例、右側(cè)35例，KL 分級(jí)：KL-220 例、KL-337 例、KL-417 例；同期選取體檢健康人員100 例為對(duì)照組，男51 例，女49 例，年齡60.00±7.65 歲，BMI 指數(shù)24.41±2.71 kg·m-1。對(duì)比兩組臨床資料情況，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），研究具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南（2010 年）》[11]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；存在膝關(guān)節(jié)疼痛、轉(zhuǎn)側(cè)不利等癥狀表現(xiàn)；X 線片檢查顯示有骨贅形成，Kellgren-Lawrence 分級(jí)2～4 級(jí)；膝關(guān)節(jié)晨僵時(shí)間＜30 min，活動(dòng)時(shí)出現(xiàn)明顯骨磨音；健康對(duì)照者身體健康，無(wú)任何疾??；簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎；膝關(guān)節(jié)急性外傷；膝關(guān)節(jié)存在外傷；患痛風(fēng)、關(guān)節(jié)感染、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等系統(tǒng)性炎癥疾??；患自身免疫性疾病、代謝性疾病；患膝關(guān)節(jié)腫瘤或其他惡性腫瘤；既往存在膝關(guān)節(jié)穿刺、關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物治療或手術(shù)史。

1.2 方法

1.2.1 CCL18、TIMP-1、Apelin 水平測(cè)定

入組當(dāng)日取患者空腹靜脈血5 mL，常溫靜置后以3500 r·min-1轉(zhuǎn)速高速離心10 min 分離上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定CCL18、TIMP-1、Apelin 水平。具體方法：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣片，混勻，覆膜，孵育60 min。棄孔內(nèi)液體，甩干，清洗反應(yīng)板。加入100 μL CCL18、TIMP-1、Apelin 檢測(cè)液，覆膜，孵育60 min，棄孔內(nèi)液體，甩干、洗滌反應(yīng)板，加入100uL 底物溶液，遮光顯色0.5 h，加入終止液，輕彈酶標(biāo)板終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀（型號(hào)iMark，Bio-RAD 公司）測(cè)定450 nm 處吸光值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算指標(biāo)含量。所有操作由高資歷檢驗(yàn)醫(yī)生嚴(yán)格遵循試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)估

采用美國(guó)西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（Western Ontario and McMaster University osteoarthritis index，WOMAC）[12]從疼痛、僵硬、關(guān)節(jié)功能3 個(gè)維度評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎患者疾病嚴(yán)重程度，共24 項(xiàng)條目，分值范圍0～96 分，WOMAC 分值與關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度呈反比。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。應(yīng)用Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，levene 法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間行F 值數(shù)據(jù)計(jì)算；計(jì)數(shù)資料以例或率（n（%））表示，組間比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平比較

如表1 所示，研究組CCL18、Apelin 水平高于對(duì)照組，TIMP-1 低于對(duì)照組，組間差異顯著（P＜0.05）。

表1 血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平比較（）

表1 血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平比較（）

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05。

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2.2 不同KL 分級(jí)血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平及WOMAC 評(píng)分比較

如表2 所示，血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平及WOMAC 評(píng)分在不同KL 分級(jí)患者中差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），KL-4 級(jí)患者血清CCL18、Apelin 水平及WOMAC 評(píng)分高于KL-3 級(jí)、KL-2 級(jí)患者，TIMP-1 低于KL-3 級(jí)、KL-2 級(jí)患者（P＜0.05）。

表2 不同KL 分級(jí)血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平及WOMAC 評(píng)分比較（）

表2 不同KL 分級(jí)血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平及WOMAC 評(píng)分比較（）

注：與KL-2 級(jí)相比，*P＜0.05；與KL-3 級(jí)相比，#P＜0.05。

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2.3 血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平與WOMAC評(píng)分的關(guān)系

如圖1 所示，以血清CCL18、TIMP-1、Apelin 進(jìn)行相關(guān)性研究，結(jié)果顯示血清CCL18、Apelin 與WOMAC 評(píng)分呈正相關(guān)，TIMP-1 與WOMAC 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。

2.4 膝骨關(guān)節(jié)炎患者疾病嚴(yán)重程度多因素Logistic 回歸分析

如表3 所示，以WOMAC 評(píng)分為因變量，將CCL18、TIMP-1、Apelin 作為自變量，賦值升高設(shè)為1，正常設(shè)為0，納入二分類多因素Logistic 回歸模型分析，結(jié)果顯示，CCL18、TIMP-1、Apelin 是影響膝骨關(guān)節(jié)炎患者病情程度的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。

表3 膝骨關(guān)節(jié)炎患者疾病嚴(yán)重程度多因素Logistic 回歸分析

注：A CCL18 與WOMAC 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.705，P=0.001）；B TIMP-1 與WOMAC 評(píng)分呈負(fù)相關(guān)（r=-0.558，P=0.012）；C Apelin 與WOMAC 評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.772，P＜0.001）。

3 討論

KOA 作為一種以骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)軟骨變性為特點(diǎn)的常見(jiàn)關(guān)節(jié)慢性退行性疾病，以中老年人員為主要發(fā)病群體，主要表現(xiàn)為疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)受限等，對(duì)患者日常生活造成影響的同時(shí)增加致殘風(fēng)險(xiǎn)[13]。數(shù)據(jù)顯示，受人口老齡化及生活不規(guī)律影響，肥胖患者逐漸增多，全球范圍內(nèi)KOA 發(fā)病率也隨之增多[14]。目前，臨床主要依靠影像學(xué)改變?cè)u(píng)估KOA 嚴(yán)重程度，但該方法成本高、缺乏客觀指標(biāo)，因而尋求新的生物標(biāo)志物對(duì)疾病診斷及疾病嚴(yán)重程度評(píng)估具有獨(dú)特意義[15]。KOA 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與細(xì)胞因子、蛋白酶等作用相關(guān)[16]。研究顯示，長(zhǎng)期慢性炎癥的損傷及修復(fù)與KOA 發(fā)生及疾病見(jiàn)長(zhǎng)存在密切關(guān)聯(lián)。CCL18 作為重要趨化因子，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中高表達(dá)[17]。研究顯示，CCL18 濃度在KOA 患者外周血中呈異常高表達(dá)，并隨KOA 疾病嚴(yán)重程度增加而升高，提示CCL18 在KOA 嚴(yán)重程度中的可能作用[18]。本文研究結(jié)果顯示，CCL18 在KOA 患者血清中呈現(xiàn)異常波動(dòng)，且其濃度變化與KOA 患者KL-分級(jí)呈線性相關(guān)，表明監(jiān)測(cè)KOA 患者CCL18 變化可對(duì)疾病進(jìn)展做出評(píng)估。TIMP-1 是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的重要細(xì)胞因子，其水平變化與關(guān)節(jié)軟骨機(jī)制降解和軟骨細(xì)胞功能關(guān)系密切[19]。研究顯示，TIMP-1 作為MMP-3 抑制物，可1: 1 結(jié)合活化MMP-3 形成復(fù)合物，可通過(guò)特異性抑制MMP-3 活性，避免軟骨基質(zhì)裂解，并隨病情加重逐漸降低；此外研究顯示，KOA 患者血清TIMP-1 水平顯著低于對(duì)照組，推測(cè)TIMP-1 在KOA發(fā)病機(jī)制中的可能作用[20-21]。通過(guò)對(duì)比2 組研究結(jié)果，TIMP-1 在KOA 血清中呈異常表達(dá)，且其水平變化KL-分級(jí)變化而變化，并與WOMAC 評(píng)分呈線性相關(guān)，提示TIMP-1 與KOA 發(fā)生及疾病進(jìn)展存在關(guān)聯(lián)，可通過(guò)監(jiān)測(cè)其水平變化評(píng)估KOA 病情嚴(yán)重程度。隨研究深入發(fā)現(xiàn)，成骨細(xì)胞表達(dá)Apelin 及其受體APJ，Apelin 通過(guò)APJ 促進(jìn)成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、增殖的同時(shí)抑制成骨細(xì)胞凋亡[22-23]。研究顯示，Apelin 水平隨KOA 患者KL-分級(jí)升高而升高，提示Apelin 在骨代謝及骨重建中的重要作用[24]。通過(guò)對(duì)比兩組研究結(jié)果，KOA 患者血清中Apelin 呈現(xiàn)異常波動(dòng)，且其水平變化與KOA 病情程度變化相關(guān)，并隨疾病加重而升高，表明監(jiān)測(cè)KOA 患者Apelin 變化可對(duì)疾病進(jìn)展作出判斷。此外本研究研究經(jīng)多因素Logistic 回歸模型分析證實(shí)CCL18、TIMP-1、Apelin 為影響KOA 疾病嚴(yán)重程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床可通過(guò)測(cè)定上述指標(biāo)水平變化為KOA 疾病嚴(yán)重程度評(píng)估提供信息支持。綜上所述，隨病情嚴(yán)重程度發(fā)展KOA 患者機(jī)體內(nèi)血清CCL18、TIMP-1、Apelin 水平呈異常波動(dòng)，血清CCL18、TIMP-1、Apelin 變化與WOMAC 評(píng)分呈線性相關(guān)，且CCL18、TIMP-1、Apelin 作為影響KOA進(jìn)展的獨(dú)立影響因素，為臨床判斷KOA 病情程度評(píng)估提供信息支持。故CCL18、TIMP-1、Apelin 在KOA 病情程度判斷中具有潛在廣闊的應(yīng)用前景，有望發(fā)展為KOA 病情判斷的重要輔助指標(biāo)，為臨床治療方案確定提供更為準(zhǔn)確的量化參考。