植物乳植桿菌BXM2產γ-氨基丁酸的發酵條件優化及特性研究

◎ 朱永樂，宋貴梅，喬榮更，湛劍龍，趙大洲，吳瓊琳

（廈門元之道生物科技有限公司，福建 廈門 361100）

γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric Acid，GABA），又名氨酪酸[1]，為非蛋白質的天然氨基酸，常由生物體內轉化而得[2]。GABA 作為一種活性氨基酸，具有促進機體葡萄糖代謝、降血壓、鎮靜、抗焦慮、預防或治療癲癇，改善肝臟、腎臟功能等多種作用[3-6]。目前GABA 已廣泛應用于食品、保健品中，含GABA的主要產品有飲料、膠囊、壓片糖果以及軟糖等。

γ-氨基丁酸在天然物質中含量較低，無法滿足工業上的需求[5-6]。目前獲得γ-氨基丁酸的主要方法有植物富集法、化學合成法、微生物發酵法，與其他兩種方法相比，微生物發酵法具有專一性強、生產周期短、環保、操作簡單等優點[7-10]。植物乳植桿菌為可食用菌種，為微生物發酵法生產γ-氨基丁酸的主要菌種之一，在開發健康安全的GABA 功能性食品領域中具有重要意義[11]。然而，在發酵過程中，γ-氨基丁酸產量受多種因素的影響，不同來源的乳酸菌產γ-氨基丁酸的能力也各有差異。

本課題在前期工作中分離篩選得到植物乳植桿菌BXM2，以該菌株為研究對象，通過單因素實驗和響應面實驗以γ-氨基丁酸產量為響應值，對發酵條件進行優化，并對菌株耐膽鹽、耐酸的特性進行研究，以期為后續研究菌株BXM2 功能及應用提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳植桿菌BXM2（Lactiplantibacillus plantarumBXM2）： 中國微生物菌種保藏中心（CGMCC NO.16436）；甲醇、乙腈、氫氧化鈉、乙酸、乙酸鈉：西隴科學股份有限公司；鄰苯二醛、四氫呋喃、巰基乙醇：阿拉丁試劑（上海）有限公司；三乙胺：西亞試劑；γ-氨基丁酸標品：北京中科質檢生物技術有限公司；豬膽鹽：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的活化

從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌株植物乳植桿菌BXM2，于MRS 液體培養基中活化至二代，培養溫度為37 ℃，培養時間為24 h，培養條件為厭氧培養，備用。

1.3.2 菌株耐受性分析

（1）耐酸實驗。用稀鹽酸將配制好的MRS 液體培養基的pH 值調節至1.5、2.5、3.5，于121 ℃滅菌15 min。待培養基冷卻至室溫后，將培養至二代的菌液以3%（體積分數）接種至培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養，并測定發酵2 h 的活菌數。

（2）耐膽鹽實驗。向MRS 液體培養基中添加0.03%、0.30%、0.50%的膽鹽于121 ℃下滅菌15 min。待培養基冷卻后向其加入3%的二代菌液，置于37 ℃恒溫培養箱中厭氧培養，測定發酵2 h 的活菌數。

1.3.3 發酵條件優化

以5%的菌株接種量向MRS 培養基中接入活化至二代的菌液，于37 ℃下培養24 h，取發酵液離心（5 000 r·min-1，10 min，4 ℃)，取上清液并測定γ-氨基丁酸含量。

（1）單因素實驗。按1%、3%、5%、7%和9%（體積分數）接入二代活化菌液，其余條件固定，測定培養基上清液γ-氨基丁酸含量；調整發酵時間為20 h、24 h、28 h、32 h 和36 h，其他條件固定，測定γ-氨基丁酸含量；調整發酵溫度為27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃和45 ℃，其他條件固定，測定γ-氨基丁酸含量。

（2）響應面實驗。在單因素實驗的基礎上進行響應面優化實驗，以γ-氨基丁酸含量為響應值，使用Design Expert 10 對其進行分析，優化發酵工藝條件，因素水平設計見表1。

表1 響應面實驗水平設計表

1.3.4 γ-氨基丁酸含量測定

本文采用高效液相色譜法測定γ-氨基丁酸含量，檢測器為紫外分光光度檢測器，采用外標法進行定量。

（1）色譜條件。色譜柱：C18柱（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相A：8 g·L-1結晶乙酸鈉+三乙胺+四氫呋喃（pH 值為7.2±0.02）；流動相B：8 g·L-1結晶乙酸鈉∶乙腈∶甲醇=1 ∶2 ∶2（體積比）（pH 值為7.2)；檢測波長：338 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL·min-1。梯度洗脫程序見表2。

表2 洗脫程序表

（2）試劑及標準曲線繪制。衍生試劑：0.1 g鄰苯二醛（OPA）+1 mL 乙腈+13 μL 巰基乙醇，用0.4 mol·L-1硼酸緩沖液定容至10 mL。氨基丁酸標準曲線的繪制：根據QB/T 4587—2013 方法有所調整，將標準溶液配制成濃度為12 μg·mL-1、22 μg·mL-1、42 μg·mL-1和58 μg·mL-1的系列溶液，添加等體積的衍生試劑，衍生2 min，并繪制標準曲線。得到回歸方程為y=12 034.4x，R2=0.999 6。

1.4 數據處理

利用Excel 2021 處理數據，采用Origin 2018 作圖，實驗數據以平均值±標準差表示；通過SPSS 22.0 進行單因素方差分析（ANOVA），Duncan 法進行顯著性差異分析（n=3）；由Design Expert 10 設計響應面實驗。

2 結果與分析

2.1 菌種耐受性實驗結果

益生菌進入人體胃腸道后可發揮本身的益生功能，但是乳酸菌的存活力會受到胃酸及膽鹽的影響，因此對乳酸菌消化環境的耐受力篩選至關重要。體外消化模擬環境可為益生菌的定植能力提供理論依據[12]。研究表明，人體胃環境的pH 值一般在1.3 ～2.0，食物排空時間一般為1 ～2 h[13-14]。因此本實驗選取pH 值為1.5、2.5、3.5，消化時間為2 h 進行實驗。如圖1（a）所示，發酵原液中活菌數與各pH 條件下消化2 h 的活菌數有顯著差異（P＜0.05）；pH 值為1.5、2.5、3.5 的條件下，活菌數由原液中的9.2×108CFU·mL-1分別降至1.1×105CFU·mL-1、1.2×105CFU·mL-1、6×106CFU·mL-1。

圖1 菌株BXM2 在不同pH、不同濃度膽鹽條件下的活菌數變化圖注：不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）。下同。

據報道，膽鹽對乳酸菌的耐受性有一定影響，而人體膽汁中含有大量的膽鹽[15]。從圖1（b）中可以看出，BXM2 植物乳植桿菌對膽鹽的耐受性與膽鹽添加量呈負相關（P＜0.05）。膽鹽濃度為0.50%、消化2 h 時，BXM2 植物乳植桿菌活菌數為9.8×105CFU·mL-1。

綜上，BXM2 植物乳植桿菌在膽鹽和酸性環境下均有一定耐受能力，能在發酵液中存活，有利于在腸道中定植，發揮益生功效。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 發酵時間

從圖2 可以看出，隨著發酵時間的延長，γ-氨基丁酸含量整體上呈先增大后降低的趨勢。發酵時間為32 h時，γ-氨基丁酸含量達到最大值，為（153.55±8.76）μg·g-1；繼續延長發酵時間，γ-氨基丁酸含量顯著降低（P＜0.05），可能是由于發酵體系中菌種為滿足自身營養需求充分利用了代謝產物[16]。

圖2 發酵時間對γ- 氨基丁酸含量的影響圖

2.2.2 發酵溫度

如圖3 所示，隨著溫度的升高，γ-氨基丁酸含量先增大后顯著減小（P＜0.05），可能是溫度的升高有利于乳酸菌生長和谷氨酸脫羧酶的產生[17]。當發酵溫度為37 ℃時，γ-氨基丁酸的產量最大，其含量為（359.64±19.77）μg·g-1；當溫度為42 ℃時其含量顯著降低（P＜0.05），可能是溫度過高，影響了菌株的生長。

圖3 發酵溫度對γ-氨基丁酸含量的影響圖

2.2.3 接種量

如圖4 所示，隨著菌株接種量的增加，γ-氨基丁酸的含量先增大后減小。當接種量過小時，培養時間延長，導致生產率降低；當接種量過高時，會過早消耗培養基中的營養成分，進而消耗菌株生長過程中代謝產生的γ-氨基丁酸[18]；當菌株接種量為3%時，γ-氨基丁酸含量達到最大值，為（308.23±8.12）μg·g-1。

2.3 響應面優化實驗

以單因素實驗為基礎，以γ-氨基丁酸含量（Y）為響應值，結合Box-Behnken 對發酵條件進行優化，響應面實驗結果見表3，多元回歸分析結果見表4。回歸方程為Y=481.26+1.98A-0.25B+15.81C+18.01AB+13.43AC-1.05BC-70.63A2-53.29B2-24.83C2。方程模型顯著，P＜0.05；失擬項R=0.637 2 ＞0.5，不顯著。通過以上分析可以得出該模型可應用于預測植物乳植桿菌BXM2 最佳發酵條件下γ-氨基丁酸含量。從表4 可以得出，對BXM2 產γ-氨基丁酸含量影響的順序為接種量＞發酵時間＞發酵溫度。其中發酵時間和發酵溫度二次項對γ-氨基丁酸含量有極顯著影響，P＜0.01。

表3 響應面實驗設計及結果表

表4 回歸方程分析表

各因素對γ-氨基丁酸含量的交互影響見圖5 ～圖7。響應面曲線越陡峭，影響越明顯，因素間交互作用越顯著；等高線越趨近于橢圓形[19]，則說明兩因素間的影響越顯著。由此可知，發酵時間與發酵溫度的交互作用與其他兩組交互作用相比影響更加明顯，與方差分析中結果一致。

圖5 AB 交互作用圖

圖6 AC 交互作用圖

圖7 BC 交互作用圖

經模型擬合得到的響應面優化實驗結果為發酵時間32.18 h、發酵溫度37.010 ℃、接種量3.66%，預測γ-氨基丁酸最含量為483.924 μg·g-1。考慮實驗結果可能存在誤差，將發酵條件調整為發酵時間32.2 h、發酵溫度37 ℃、接種量3.7%，該條件下的γ-氨基丁酸含量為479.23 μg·g-1，與響應面預測值相比誤差率為0.969%，實驗數據與理論預測相差不大，由此說明該模型具有可靠性。

3 結論

本文通過單因素實驗結合響應面優化實驗對BXM2 發酵產γ-氨基丁酸的發酵條件進行優化，得到最佳的發酵條件為發酵時間32.2 h、發酵溫度37 ℃、接種量3.7%，該條件下γ-氨基丁酸的含量為479.23 μg·g-1。通過測定BXM2 在不同pH 值、不同膽鹽濃度下的活菌數，發現BXM2 具有良好的耐受力，有利于在腸道中定植，發揮益生功效，可選作優秀菌株進行研究與開發。