超聲輔助法提取柚子皮多酚的工藝優化

◎ 羅亞惠，宿珠琳，馬永生，鄒 建

（河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000）

柚子，又名文旦、氣柑，蕓香科柑橘屬植物，具有清肺、健胃、促進消化等功效[1]，還富含維生素、礦物質、糖類等營養素。柚子皮占柚子鮮重的20%～50%[2]，是柚子的重要副產物，富含多酚、多糖、黃酮和果膠等天然活性成分[3]，其中多酚類化合物具有降血脂[4]、降血糖[5]、抗氧化[6]以及殺菌抗炎[7-9]等功效，在食品和醫藥行業具有廣泛的應用前景[10]。我國柚子栽培歷史悠久，產量豐富，年產量約500 萬t[11]，除去鮮食果肉外，大量柚子皮被丟棄，不僅污染環境，還造成了天然資源的浪費。

本文以柚子皮為原料，通過超聲輔助法提取柚子皮中的多酚，并通過單因素實驗和Box-Behnken 實驗對提取工藝進行優化，為柚子皮的綜合利用及開發提供思路，以期減少天然多酚資源的浪費與環境污染。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

柚子：產自福建漳州的琯溪蜜柚，形態良好，無病蟲害；福林酚試劑、沒食子酸標準品，上海麥克林生化科技有限公司；乙醇、碳酸鈉，天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高速離心機JW-2018H，安徽嘉文儀器裝備有限公司；紫外可見分光光度計UV-1500，上海美析儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9140 型，上海三發科學儀器有限公司；智能靜音超聲清洗機XM-700UVF，小美超聲儀器有限公司；高速萬能粉碎機FW177 型，上海本亭儀器有限公司；恒溫水浴鍋HH-4，國華（常州）儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柚子皮樣品處理

將新鮮、無腐壞的柚子皮清洗干凈，置于30 ℃烘箱中烘干，隨后用萬能粉碎機將烘干的柚子皮粉碎后過篩，密封避光保存備用（4 ℃）。

1.3.2 柚子皮中多酚的提取

稱取柚子皮粉末0.500 g 于錐形瓶中，加入10 mL、60%的乙醇溶液，搖勻后超聲處理，之后將溶液4 000 r·min-1離心處理10 min，將上清液置于燒杯中，剩余沉淀用10 mL、60%的乙醇溶液重復提取2 次，將離心后的所有上清液合并，低溫避光儲存。

1.3.3 多酚含量的測定

分別配制濃度為0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1的沒食子酸標準溶液。分別吸取100 μL 不同濃度的沒食子酸溶液，加入0.5 mL 福林酚試劑和2 mL 15%碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至50 mL，于40 ℃水浴反應20 min，在765 nm 處測定吸光值[12]。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到沒食子酸的標準曲線為y=0.134 2x-0.035 8，R2=0.998 9。

取稀釋后的樣品溶液50 μL 與50 μL 福林酚試劑混合、搖勻，再加入800 μL 蒸餾水，混勻后室溫下放置5 min，將800 μL 7.5% Na2CO3溶液添加到混合液中，混合均勻，于黑暗處室溫反應1 h，在765 nm 處測量吸光度值，通過沒食子酸標準曲線計算多酚含量。利用公式（1）計算柚子皮多酚提取量。

柚子多酚提取量=(C×X×V)/M×100%

（1）

式中：C為柚子多酚質量濃度，mg·mL-1；X為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；M為樣品質量，g。

1.3.4 單因素實驗

以多酚提取量為考察指標，按照1.3.2 多酚提取方法，基礎控制量為料液比1 ∶20（g ∶mL）、乙醇濃度60%、提取時間30 min、提取溫度35 ℃、超聲功率420 W。分別研究提取時間（20 min、30 min、40 min、50 min 和60 min）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%和80%）、提取溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、料液比（1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60，g ∶mL）及超聲功率（420 W、490 W、560 W、630 W 和700 W）對柚子皮多酚提取量的影響。

1.3.5 響應面分析實驗

根據單因素實驗結果，使用Design Expert 13.0 軟件，設計3 因素3 水平響應面實驗，并分析結果得出最佳提取工藝，因素水平編碼見表1。

表1 響應面分析因素水平設計表

1.4 數據處理

每組實驗重復3 次并取平均值。采用Office 2017及SPSS 進行數據處理，利用Design Expert 13.0 進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間的篩選

由圖1 可知，隨著提取時間的延長，柚子皮中多酚提取量呈現先升高后降低趨勢。提取時間為30 min時，柚子皮多酚的提取量最高，為3.37 mg·g-1，繼續延長提取時間，柚子皮多酚提取量降低。這可能是因為提取時間過短，柚子皮中多酚不能充分被提出，提取量較低；而提取時間過長則會造成多酚的氧化與破壞，繼而影響其提取量[13-14]。故本文將提取時間確定為30 min。

圖1 提取時間對柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.2 提取溫度的篩選

由圖2 可知，提取溫度在25 ～40 ℃時，柚子皮多酚提取量隨溫度升高呈現先降低后升高的趨勢。在40 ℃時，提取量最高，達到2.82 mg·g-1，這可能是由于溫度的上升加快了分子的運動速率，軟化了柚子皮細胞內組織，導致柚子細胞的細胞壁急劇破壞，加速了多酚物質的析出。當提取溫度超過40 ℃時，隨著溫度上升提取量下降，這可能是因為溫度過高破壞了細胞結構，導致多酚類物質發生部分氧化，多酚提取量下降[14]。故提取溫度確定為40 ℃。

圖2 提取溫度對柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.3 料液比的篩選

由圖3 可知，料液比為1 ∶50 時，柚子皮多酚的提取量最高，為3.41 mg·g-1。繼續增大提取液用量，柚子皮多酚的提取量降低，可能是由于此時乙醇對多酚的提取量已經達到了飽和，多酚不再溶出。故料液比確定為1 ∶50（g ∶mL）。

圖3 料液比對柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.4 乙醇濃度的篩選

由圖4 可知，乙醇濃度在40%～80%時，隨著乙醇濃度的增大，多酚提取量先升高后降低后又升高。當乙醇濃度在60%時多酚提取量最大（2.18 mg·g-1）；繼續增大乙醇濃度至70%，多酚提取量逐漸降低。這可能是因為乙醇濃度過高，導致蛋白質變性，從而阻礙了酚類物質的溶出[15]。乙醇濃度為60%和80%時，多酚提取量并無明顯差異，為節約提取成本，將乙醇濃度確定為60%。

圖4 乙醇濃度對柚子皮多酚提取量的影響圖

2.1.5 提取功率的篩選

由圖5 可知，超聲功率在420 ～560 W 時，柚子皮多酚的提取量呈先降低后升高的趨勢，在560 W 時達到最高，為2.49 mg·g-1，但與該范圍其他功率下的提取量無明顯差異。超聲功率超過560 W，隨著功率的增大，柚子多酚的提取量逐漸下降。這可能是超聲功率的增大，破壞了酚類物質的結構，導致提取量下降[16]。故超聲功率確定為560 W。

圖5 超聲功率對柚子皮多酚提取量的影響圖

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗設計及結果

響應面優化超聲提取柚子皮多酚的實驗設計及結果見表2。利用Design Expert 13.0 軟件對表2 數據進行二次多項式回歸擬合，得到實驗條件與響應值之間的回歸模型方程式為

表2 響應面試驗設計及結果表

對表2 中數據進行分析，結果見表3。回歸模型中P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著；失擬項P＞0.05 不顯著，表示未知因素對結果影響小；R2=0.989 6，，說明該模型擬合性良好，可以用作超聲提取柚子皮多酚的工藝優化[17-18]。回歸方程的一次項B和二次項A2、C2都達到極顯著水平，且提取時間A、料液比B、提取溫度C3 個因素對柚子皮多酚提取量的影響大小為B＞C＞A。此外，提取時間和料液比（AB）、提取時間和提取溫度（AC）的交互作用對多酚提取率也有顯著影響。

表3 回歸模型的方差分析表

2.2.2 不同因素間交互作用的響應面分析

二維等高線圖的形狀和密集程度及三維響應面圖的陡峭程度可以判斷不同因素間的交互作用，等高線趨于橢圓、越密集代表兩個因素的交互作用越明顯，反之，則表示兩個因素之間的交互作用不明顯[19-20]。

圖6 ～圖8為各因素的交互情況。可以看出，料液比和提取時間（AB）、溫度和提取時間（AC）的等高線較密集，并呈橢圓，響應面坡度較陡，說明AB、AC兩兩的交互作用對多酚提取量的影響較大。而料液比和提取溫度（BC）的等高線較稀疏，說明BC交互作用對多酚提取量的影響不顯著，這與方差分析的結果一致。

圖6 提取時間和料液比交互作用圖

圖7 提取時間和提取溫度交互作用圖

圖8 提取溫度和料液比交互作用圖

2.2.3 最優工藝參數及驗證試驗結果

利用DesignExpert 13.0 軟件，通過響應面分析及預測，得到超聲提取柚子皮多酚的最佳工藝條件為提取時間32.83 min、料液比1 ∶54.86（g ∶mL）、提取溫度39.53 ℃，在此條件下柚子皮多酚提取量的預測值為7.655 mg·g-1。為驗證響應面預測值的準確性，本文結合實際將實驗條件調整為提取時間33 min、料液比1 ∶55（g ∶mL）、提取溫度40 ℃，實驗重復3 次，得到的柚子皮多酚提取量為7.589 mg·g-1，RSD為0.61%，實際值與預測值相近，說明此模型可靠，可以用來預測柚子皮多酚的提取量。

3 結論

本文以超聲輔助提取法為基礎，通過單因素實驗和響應面優化法確定了柚子皮多酚的最佳提取工藝。優化得到柚子皮多酚最佳提取工藝為提取時間33 min、提取溫度40 ℃、料液比1 ∶55（g ∶mL）、乙醇濃度60%、提取功率560 W。在此工藝下，柚子皮多酚提取量為7.589 mg·g-1，與模型預測值基本一致。