響應面優化羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉的工藝及理化性質研究

◎ 呂藝揚

（仲愷農業工程學院 輕工食品學院，廣東 廣州 510225）

馬蹄，又叫荸薺，在我國多地均有種植。其營養豐富，具有清熱明目、生津止渴、清肺化痰、利腸通便等功效，含有豐富的蛋白質、膳食纖維、維生素等[1-2]。馬蹄是廣西產量較高的一種傳統優勢農產品，大多數企業將馬蹄加工成“清水馬蹄”罐頭，其余鮮銷馬蹄占馬蹄總產量的80%以上，但存在損壞率高、運輸不方便等問題[3]。新鮮的馬蹄在加工過程中會因機械傷造成的組織外露而導致褐變[4]，如能研究出一種馬蹄抗性淀粉的生產方法，將極大提升馬蹄的深加工水平，同時作為馬蹄高值化的一個方向，將大幅促進賀州馬蹄產業的發展。

抗性淀粉（Resistant Starch，RS）具有類似溶解性纖維的性質，能夠起到與膳食纖維相似的功效，是膳食纖維很好的替代品，能夠預防人們由于缺乏膳食纖維而導致的一系列疾病。它的主要生理功能有降血糖血脂、控制體重和抗癌，同時可改善人體腸道菌群結構[5]。呂明彧等[6]通過建立肥胖小鼠模型對小鼠進行多元復合抗性淀粉灌胃，發現多元復合抗性淀粉可以增強飽腹感使小鼠攝入食物量降低，可達到減肥降脂的效果。此外，抗性淀粉在棉花糖、巧克力等糖果的制造以及固體飲料的生產、面條的生產、糕點的生產中均有應用，可以調整產品的黏度，具有良好的保水性[7]。

抗性淀粉除了天然存在外，還可以通過對淀粉進行改性得到。根據其不同的來源和不同的抗酶解性能，可分物理包埋、老化回生和化學改性幾種淀粉[8-9]。在制備抗性淀粉的方法中，物理方法改性和酶法改性由于所得產品相對安全[10]，現階段研究人員較多，是國內外研究熱點，但物理方法往往會對淀粉顆粒結構造成破壞。范會平等[11]對比了經過蒸制、老化、冷凍等處理后的全粉蒸煮損失率、微觀結構、流變特性以及抗性淀粉含量變化，得出不同處理方法對全粉影響顯著的結論。熱處理時間過長將使抗性淀粉含量大幅降低，且伴隨的壓熱處理等處理方式也會對能源產生極大的消耗，給環境帶來一定的負擔。化學法制備抗性淀粉所需要的溫度較低，無須冷凍處理，相對節能、節時，具有極大的研究價值。牛博文等[12]對比了3 種化學方法制得的紅薯抗性淀粉的酶解性、溶解性、持水性、膨潤度、透明度、凍融性等指標，結果表明醚化淀粉各方面性質為最優。羧甲基醚化淀粉是醚化劑與淀粉中糖苷鍵或活性羥基在堿性的淀粉乳液條件下，發生取代反應得到的一種淀粉衍生物。彭麗等[13]以一氯乙酸為醚化劑，對大米淀粉進行改性，成功制得羧甲基醚化大米抗性淀粉，其產品具有良好的穩定性，各項理化性質均較優，由此可考慮以一氯乙酸作醚化劑，對馬蹄抗性淀粉進行醚化處理。

本實驗通過單因素試驗和響應面設計優化羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉的工藝參數，以期為羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉提供理論依據及生產指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本文所用材料與試劑見表1。

表1 材料與試劑表

1.2 儀器與設備

本文使用的儀器與設備見表2。

表2 儀器與設備表

1.3 試驗方法

1.3.1 馬蹄抗性淀粉的制備

用與淀粉質量比為1.058 ∶1 的氫氧化鈉和85%乙醇配制一定梯度質量分數的淀粉乳液，移入30 ℃恒溫水浴鍋中加熱堿化60 min，加入一定量的一氯乙酸固體，攪拌均勻，設置一定的反應溫度，醚化一定時間，反應結束后用鹽酸滴定溶液pH 值至中性，用85%乙醇沖洗4 ～5 次至溶液中無氯離子，抽濾得到白色或淡黃色的固體或粉末，在45 ℃恒溫鼓風干燥箱中干燥24 h 以上，粉碎并過100 目篩，得到羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉與馬蹄淀粉的混合物[14]。

1.3.2 馬蹄抗性淀粉純化

稱量上述方法制得的馬蹄抗性淀粉1 g于離心管中，將pH 值為6 的磷酸鹽緩沖液按1 ∶12.5 的質量比加入離心管，振蕩均勻后，加入0.2 mL（20 000 U·mL-1）的耐高溫α-淀粉酶溶液，混勻，將離心管放進95 ℃的水浴恒溫振蕩器中水浴2 h，取出后冷卻至室溫，用4 mol·L-1檸檬酸溶液調節pH 值為4.6 ～4.8，加入1 mL（100 U·mL-1）糖化酶溶液，于60 ℃水浴恒溫振蕩器中水浴1.5 h，取出后冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心5 min，取出后倒去上清液，將沉淀依次用95%、85%、75%的乙醇溶液洗滌4 ～5 次，將沉淀45 ℃干燥烘干24 h 以上，得到羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉[15-16]。

1.3.3 單因素試驗

（1）淀粉乳液濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇5%、10%、15%、20%、25%、30% 6 種馬蹄淀粉乳濃度，保持一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比為1∶1（即醚化劑一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質量的100%，下同），設置醚化反應條件為溫度40 ℃，醚化反應時間4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（2）醚化劑用量對馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比為1 ∶4、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、4 ∶1（即醚化劑一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質量的25%、50%、100%、200%、400%）這5 個不同的醚化劑用量，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，設置醚化反應條件為溫度40 ℃，醚化反應時間4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（3）醚化溫度對馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃ 6 個不同的醚化溫度，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比為1 ∶1，醚化時間為4 h。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

（4）醚化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響。選擇1 h、2 h、3 h、4 h、5 h 5 個不同的醚化時間，保持馬蹄淀粉乳濃度為15%，一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比為1 ∶1，設置醚化溫度為40 ℃。不改變其他條件，測定馬蹄抗性淀粉的得率。

1.3.4 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，參考Box-Behnken 設計原理，選擇淀粉乳液濃度、一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比、醚化溫度作為研究因素，響應值設置為馬蹄抗性淀粉得率，設計3 因素3 水平響應面試驗。因素水平及相應編碼設計情況見表3。

表3 因素水平及編碼表

1.3.5 指標測定及表征

（1）馬蹄抗性淀粉得率。單次試驗純化得到的羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉質量m1與單次試驗所用到的馬蹄淀粉質量m2的比值即為馬蹄抗性淀粉得率。計算公式為

（2）感官分析。從醚化后性狀、分離純化后性狀、塊狀物性狀、干燥后產品質地幾個方面對響應面試驗過程中及結束后的產品性狀進行比較。

（3）持水性。參考劉云芬等[17]的方法，分別稱取馬蹄抗性淀粉和馬蹄淀粉1 g 溶解于10 mL 去離子水，計為m3，置于80 ℃水中，進行水浴加熱30 min，冷卻到室溫后，13 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，稱量離心管和沉淀重量計為m5[18]；離心管的重量計為m4。持水性計算公式為

（4）透明度。參考邵華為等[18]的方法，將樣品配制成1%（m/V）的淀粉乳，沸水浴中加熱攪拌30 min，充分糊化后，冷至室溫，保持原體積。用1 cm比色皿于650 nm 波長下測定糊的透光率，以蒸餾水作為空白。

（5）掃描電鏡。參考彭麗等[13]的方法，將樣品提純后，充分干燥，于掃描電鏡下觀察樣品形態。

（6）紅外光譜分析。參考相關研究[19-20]方法，將樣品提純后，充分干燥，將樣品放入研缽中，加入干燥的光譜純KBr 200 mg，混合研磨均勻（在紅外燈下），使其粒度在2.5 μm 以下，裝入壓片模具，抽氣壓片，紅外光譜儀分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 淀粉乳液濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖1 可知，當馬蹄淀粉乳濃度為15%時，羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率最高，為38.27%；繼續增大馬蹄淀粉乳濃度，羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率呈下降趨勢。羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的形成與馬蹄淀粉乳體系的濃度有關，當馬蹄淀粉乳的濃度較低時，淀粉分子分離程度較大，有序結晶序列不易形成[21]。當馬蹄淀粉乳的濃度較高時，不利于分子流動，亦將影響分子重排列和結晶[22]；試驗中觀察到，濃度過高的馬蹄淀粉乳液難以混勻和分散，導致后期加入一氯乙酸后可能反應不完全，致使產品得率降低。

圖1 淀粉乳濃度對抗性淀粉得率的影響圖

2.1.2 醚化劑用量對馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖2 可知，在一氯乙酸與馬蹄淀粉的質量比為1 ∶1（即一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質量的100%）時，馬蹄抗性淀粉得率達到最高，為57.89%，隨后呈現下降趨勢。該試驗結果說明，醚化劑用量并非越多越好，足量的醚化劑能使淀粉得到充分的反應，提高馬蹄抗性淀粉的得率；而過量的一氯乙酸則無法繼續提高馬蹄抗性淀粉的得率，且會導致淀粉乳液整體偏酸性。羧甲基醚化淀粉是由淀粉與氯乙酸在堿性條件下發生雙分子親核取代反應制得，故酸性的乳液條件將不利于反應進行[23-25]。

圖2 醚化劑用量對抗性淀粉得率的影響圖

2.1.3 醚化溫度對馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖3 可知，在醚化溫度為40 ℃時，馬蹄抗性淀粉得率最高，為62.38%；繼續升高醚化溫度，馬蹄抗性淀粉得率基本呈下降趨勢。原因是醚化溫度如果過低，分子運動較慢，反應速度較慢，影響抗性淀粉的形成；醚化溫度過高，溶液會形成膠黏結構，溫度越高，膠黏越明顯，越接近固態，不利于分子運動，不利于反應進行。此外，隨醚化溫度的升高，水分揮發流失較多，淀粉乳液濃度增大，也會使溶液越發黏稠。同時，副反應的發生亦不利于馬蹄抗性淀粉的形成[26-29]。

圖3 醚化溫度對抗性淀粉得率的影響圖

2.1.4 醚化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響

由圖4 可知，醚化時間為2 h 時馬蹄抗性淀粉得率最高，為64.02%。初步判斷醚化1 h 時反應不充分，故馬蹄抗性淀粉得率較低。從整體上看，隨時間的延長，馬蹄抗性淀粉得率逐漸上升；但時間過長可能會使部分馬蹄抗性淀粉遭到破壞，出現大分子降解等，導致馬蹄抗性淀粉得率有所下降[30]。由于醚化時間的單因素試驗數據呈波浪形，無法看出規律，而造成數據波動的原因亦尚未確定，無法判斷最優，故不作為響應面優化中的自變量。

圖4 醚化時間對抗性淀粉得率的影響圖

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗結果與回歸方程分析

響應面試驗設計與結果如表4 所示。因素（A、B、C）和響應值（Y）之間的多元二次回歸方程為

表4 響應面試驗設計與結果表

由表5 可知，響應面試驗設計的整體模型差異顯著（P＜0.01），制備馬蹄抗性淀粉的條件可預測得到。失擬項差異不顯著（P=0.347 9 ＞0.05），表明二次回歸模型與實際情況吻合良好，可靠性高，回歸方程的擬合度較高。試驗考察的3 個因素與響應值之間不是簡單的線性關系，它們的相互改變對羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的收率影響較大。A、B、C3 個因素對羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率的影響主次順序為B＞C＞A，即醚化劑用量＞醚化溫度＞淀粉乳液濃度。

表5 響應面試驗方差分析表

2.2.2 最佳工藝參數確定與驗證

采用Desigin-Expert 8.06 軟件進行分析，得出羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的最佳制備工藝條件為馬蹄淀粉乳濃度12.26%，醚化劑用量117.92%（即一氯乙酸用量占馬蹄淀粉質量的117.92%），醚化溫度43.35 ℃，預測的最大得率為76.02%。為方便試驗的開展，將所得試驗參數調整為馬蹄淀粉乳濃度12%，醚化劑用量120%，醚化溫度43 ℃，進行3 次驗證試驗，取平均值，測得羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的得率為75.85%，基本接近預測值76.02%，模型與實際情況擬合度較好，表明工藝設計可靠性較高，有效地對制備工藝進行了優化。

2.3 感官分析

如表6 所示，醚化溫度為50 ℃的試驗組在醚化完成后均呈較硬的質地（試驗號2、5、10、11）；一氯乙酸用量150%的試驗組制得的抗性淀粉在分離純化后大多呈絮狀（試驗號6、9、11、14），一氯乙酸用量50%的試驗組醚化后多成沙狀，未形成膠黏結構，幾乎無抗性淀粉生成，或制得量較低（試驗號1、10、12、15），產品性狀的差異可能是造成羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率差異的因素之一。用羧甲基醚化法制得的馬蹄抗性淀粉產品均為膠質，緊緊貼合于干燥時所用的容器上，持水性較好，干燥時間長。

表6 響應面試驗過程中產品性狀比較表

2.4 理化指標測定與表征分析

2.4.1 持水性、透明度測定

由表7 可知，上述最優工藝下制得的羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉的持水性優于原馬蹄淀粉，可能是因為羧甲基醚化淀粉引入了親水性的羧甲基基團[31]。馬蹄抗性淀粉的透明度也優于原馬蹄淀粉，這是因為親水基團的引入會阻礙分子締合而減弱光的反射與折射；分子膨脹亦會使淀粉分子體積增大，使光的透過率有所提高[32]。

表7 原淀粉與馬蹄抗性淀粉持水性、透明度比較表

2.4.2 掃描電鏡分析

從圖5可以看出，原馬蹄淀粉顆粒較小，多為圓形，呈規律的顆粒狀，表面光滑；羧甲基醚化淀粉形貌遭到破壞，分子表面有些許凹陷和裂痕，顆粒較大，形狀不規則且存在粘連，顆粒表面有大量細小顆粒附著。由此可知，羧甲基醚化法會對淀粉顆粒的結構造成破壞和腐蝕，小顆粒的成分可能是被破壞后的淀粉小顆粒和一氯乙酸、氫氧化鈉顆粒[12]。

圖5 原淀粉與醚化淀粉形態觀察圖

2.4.3 紅外光譜分析

本試驗參考文獻[14]選取4 000 ～1 000 cm-1圖譜進行分析。由圖6 可知，原馬蹄淀粉在3 356 cm-1出現的峰是締合-OH 的伸縮振動峰，在2 931 cm-1出現的峰是C-H 非對稱伸縮振動吸收峰，在1 650 cm-1出現淀粉所吸收水分子的2個-OH剪切形成的吸收峰，在1 158 cm-1出現C-O-C 非對稱伸縮振動吸收峰，在1 018 cm-1出現C-(OH)對稱振動吸收峰，在929 cm-1、861 cm-1、764 cm-1、577 cm-1出現的峰是糖環伸縮振動吸收峰[33]。與原馬蹄淀粉圖譜相比，羧甲基醚化淀粉在1 590 cm-1、1 413 cm-1和1 320 cm-1出現明顯的吸收峰，為羧酸鹽-COO-的對稱和非對稱的收縮振動峰，可以證明原馬蹄淀粉中的-OH 已被羧甲基取代，羧基已經接入馬蹄淀粉的分子鏈中[14,30]。

圖6 原淀粉與醚化淀粉紅外圖譜

3 結論

本文以馬蹄淀粉為原料，采用羧甲基醚化法制備馬蹄抗性淀粉，并通過單因素試驗和響應面法進行工藝優化。在單因素試驗中，馬蹄淀粉乳濃度、醚化劑用量和醚化溫度對羧甲基醚化馬蹄抗性淀粉得率均存在明顯影響，而醚化時間的影響趨勢呈波浪形，綜合考慮后，選擇馬蹄淀粉乳濃度、醚化劑用量、醚化溫度進行響應面試驗。最終得到的最佳工藝條件為馬蹄淀粉乳濃度12.26%，醚化劑用量117.92%，醚化溫度43.35 ℃。為方便實驗開展，調整馬蹄淀粉乳濃度為12%，醚化劑用量為120%，醚化溫度為43 ℃，該工藝下馬蹄抗性淀粉得率為75.85%，與預測值76.02%接近，表明實驗結果可靠，可為工業化生產提供了理論參考。羧甲基醚化法制得的馬蹄抗性淀粉質地膠黏、持水度高、工藝簡單，且得率較高，生產成本較低，制得產品可用作增稠劑、涂膜劑等，用途廣泛。