Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化焙烤食品復(fù)配防腐劑的研究

◎ 劉艷芳，丁寅寅

（阜陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，安徽 阜陽 236000）

焙烤食品是以糧谷類粉料為基本原材料，適當(dāng)添加酵母、砂糖、乳品、雞蛋、食鹽、水、食用油以及各類添加劑等輔料，經(jīng)烘烤制作而成的一類方便食品，具有外形美觀、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富等特點，既可以作為飯后甜點，又能作為餐中主食，深受廣大消費者的喜愛。近年來，我國烘焙行業(yè)呈現(xiàn)出健康、快速、可持續(xù)發(fā)展的良好態(tài)勢，企業(yè)規(guī)模不斷擴大，創(chuàng)新產(chǎn)品層出不窮。為延長貨架期，往往在焙烤食品中加入丙酸鈉、丙酸鈣、脫氫醋酸鈉、山梨酸鉀及雙乙酸鈉等防腐劑[1]，但這些防腐劑多為化學(xué)合成防腐劑，雖具有良好的防腐效果，可有效延長貨架期，但長期攝入會對人體造成傷害，甚至引發(fā)慢性中毒[2]。隨著人們生活水平的提高，人們對食品安全的要求越來越高，崇尚自然、回歸自然已成為不可抗拒的潮流，一些天然存在的安全、高效防腐劑日益受到人們的青睞。

相關(guān)研究表明，茄非可食部分生物堿具有較好的抑菌作用[3]，尤其對食品中常見的腐敗菌具有很好的抑制作用，具有安全性、廣譜性、高效性等特點，是天然抑菌劑、食品防腐劑、食品保鮮劑的優(yōu)質(zhì)資源。為最大限度保持焙烤食品的風(fēng)味并達到延長貨架期的目的，本研究從腐敗的焙烤食品中分離出5 種霉菌（包括2 株黃曲霉素、2 株青霉素、1 株黑根霉素、3 株絲孢酵母菌以及3 株黑曲霉素），并根據(jù)茄非可食部分生物堿、納他霉素、乳酸鏈球菌素及ε-聚賴氨酸4 種天然防腐劑的作用原理及國家使用限量標(biāo)準(zhǔn)，分別研究其對上述5 種霉菌的抑菌能力，在確定其抑菌效果的基礎(chǔ)上，進行天然防腐劑復(fù)配產(chǎn)品的開發(fā)、應(yīng)用效果驗證，針對性地研制可用于焙烤食品的天然復(fù)合防腐劑產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料

納他霉素，鄭州春秋化工有限公司；乳酸鏈球菌素，山東元泰生物工程有限公司；ε-聚賴氨酸，上海戶實醫(yī)藥科技有限公司；供試腐敗菌（含2 株黃曲霉素、2 株青霉素、1 株黑根霉素、3 株絲孢酵母菌、3 株黑曲霉素）分離自不同的腐敗變質(zhì)焙烤食品（焙烤食品購買于阜陽市潁州區(qū)青春哆美芝蛋糕店，未添加食品防腐劑）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），上海雅吉生物科技術(shù)有限公司；茄非可食部分生物堿提取原液為實驗室自制，使用時采用稀釋法得到不同濃度的懸濁液[4]。

1.2 主要儀器設(shè)備

LC-LSH-24B 高壓滅菌鍋，湖南力辰儀器科技有限公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；303-2B 電熱恒溫培養(yǎng)箱，青島精誠儀器儀表有限公司；AirGuard 1500 潔凈工作臺，上海潤度生物科技有限公司；101-0A 精密鼓風(fēng)干燥箱，廣州翼恒儀器有限公司；SHA-B 臺式恒溫振蕩器，常州市國旺儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 單因素試驗

（1）不同天然防腐劑的使用限量?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中規(guī)定，納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸在焙烤制品及各類糕點中的使用限量分別為0.3 g·kg-1、0.250 g·kg-1、0.150 g·kg-1。而茄堿作為新型天然防腐劑，其使用限量未進行明確規(guī)定。

（2）PDA 培養(yǎng)基的制備。培養(yǎng)基干粉與蒸餾水按質(zhì)量比39 ∶1 000 的比例進行配制，加熱煮沸，完全溶解后進行分裝，高壓滅菌處理后備用。

（3）天然防腐劑溶液及菌懸液的制備。3.0 g·kg-1的納他霉素鹽酸溶液：取3.0 g 納他霉素粉末溶于一定量0.02 mol·L-1鹽酸溶液；2.5 g·kg-1的乳酸鏈球菌素溶液：取2.5 g 乳酸鏈球菌素粉末溶于一定量蒸餾水中；1.5 g·kg-1的ε-聚賴氨酸溶液：取1.5 g ε-聚賴氨酸粉末溶于一定量蒸餾水中。供試腐敗菌菌懸液的制備：將供試腐敗菌接入PDA 培養(yǎng)基，于28 ℃條件下活化培養(yǎng)48 h，從活化培養(yǎng)后的供試腐敗菌中挑取一環(huán)，移入裝有無菌水的試管中，搖勻稀釋，制成含菌量為107CFU·mL-1的供試腐敗菌菌懸液[5-6]。

（4）不同天然防腐劑對供試腐敗菌的抑制能力實驗。在PDA 培養(yǎng)基中分別添加100%、80%、60%、40%、20%及0%的納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸以及茄非可食部分生物堿提取原液，然后依次移取100 μL 至無菌的96 微孔板中，再在每孔中加入5 μL 供試腐敗菌菌懸液，于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h 后，用酶標(biāo)儀測定其在580 nm 波長下的吸光度，每組試驗平行測定3 次，根據(jù)吸光度判斷不同天然防腐劑對供試腐敗菌的抑菌能力[7]。

1.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)配天然防腐劑配方

根據(jù)單一防腐劑對供試腐敗菌的抑制效果試驗結(jié)果，以酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度為響應(yīng)值，設(shè)計4 因素3 水平試驗，優(yōu)化復(fù)配防腐劑的配比，每種防腐劑設(shè)置3 組平行試驗。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定，同一功能的食品添加劑（相同色澤著色劑、防腐劑、抗氧化劑等）在混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不應(yīng)超過1。因此，本研究復(fù)合防腐劑中，納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸及茄非可食部分生物堿的量占其各自最大使用限量百分比的和應(yīng)低于100%。依據(jù)該原則及響應(yīng)面試驗結(jié)果，優(yōu)化復(fù)配出焙烤食品天然防腐劑配方。

1.3.3 復(fù)配防腐劑抑菌能力驗證

采用1.3.2 中得到的復(fù)配天然防腐劑配方，配制復(fù)配防腐劑溶液，并將該溶液均勻噴灑于同種新鮮焙烤食品表面，對照組噴灑等量的無菌水，2 組焙烤食品在28 ℃條件下放置2 h 后取樣，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）及《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）分別測定霉菌總數(shù)和菌落總數(shù)，并觀察記錄結(jié)果。菌落總數(shù)及霉菌總數(shù)檢驗程序見圖1。

圖1 檢驗程序圖

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 納他霉素濃度

由圖2 可知，隨著納他霉素濃度的增加，酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度呈現(xiàn)先快速下降再緩慢增大的趨勢，當(dāng)納他霉素濃度為0.06 g·kg-1時，有最小吸光度，表明納他霉素在該濃度下的抑菌能力最強。

圖2 納他霉素添加量對供試腐敗菌的抑制能力圖

2.1.2 乳酸鏈球菌素濃度

由圖3 可知，隨著乳酸鏈球菌素濃度的增加，酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度呈現(xiàn)先快速下降再緩慢下降，然后緩慢增大的趨勢，當(dāng)乳酸鏈球菌素濃度為0.10 g·kg-1時，吸光度最小，表明乳酸鏈球菌素在該濃度下的抑菌能力最強。

圖3 乳酸鏈球菌素添加量對供試腐敗菌的抑制能力圖

2.1.3 ε-聚賴氨酸濃度

由圖4 可知，隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度呈現(xiàn)先快速下降再緩慢下降，然后緩慢增大的趨勢，當(dāng)ε-聚賴氨酸濃度為0.06 g·kg-1時，吸光度最小，表明ε-聚賴氨酸在該濃度下的抑菌能力最強。

圖4 ε-聚賴氨酸添加量對供試腐敗菌的抑制能力圖

2.1.4 茄非可食部分生物堿提取液濃度

由圖5 可知，隨著茄非可食部分生物堿提取液濃度的增加，酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度先下降，然后基本穩(wěn)定，當(dāng)茄非可食部分生物堿提取液濃度為20%時，吸光度較小，之后變化不大，表明茄非可食部分生物堿提取液在該濃度下的抑菌能力最強。

圖5 茄非可食部分生物堿提取液添加量對供試腐敗菌的抑菌能力圖

2.2 響應(yīng)面法復(fù)配天然防腐劑試驗結(jié)果與分析

2.2.1 試驗因素及水平

根據(jù)以上4 種防腐劑單因素抑菌能力試驗的結(jié)果，優(yōu)化濃度范圍縮小為最佳抑菌濃度的±30%[8-9]，據(jù)此設(shè)計因素水平表（表1）。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計因素水平表

2.2.2 響應(yīng)面法復(fù)配天然防腐劑試驗結(jié)果與方差分析

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以酶標(biāo)儀580 nm 波長下測定的吸光度為響應(yīng)值Y，納他霉素（A）、乳酸鏈球菌素（B）、ε-聚賴氨酸（C）、茄非可食部分生物堿提取液（D）4 種天然防腐劑的濃度為自變量，采用響應(yīng)面設(shè)計法對復(fù)配天然防腐劑配方進行優(yōu)化，從而篩選出延長焙烤食品保質(zhì)期的最佳復(fù)配天然防腐劑配方[10]，Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計方案如表2 所示，響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果如表3 所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案表

表3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析結(jié)果表

按照表2 中響應(yīng)面實驗設(shè)計方案進行試驗，測得各試驗條件下酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度值，采用Expert Design v13.0.5.0 軟件對測定數(shù)值進行線性回歸擬合方差分析，得到該模型的回歸方程為

由表3 可知，該響應(yīng)曲面模型顯著（P＜0.05），失擬項P值大于0.05，即失擬項不顯著，表明理論數(shù)值和實際測定數(shù)值之間的偏差較小，能夠使用以上回歸方程預(yù)測酶標(biāo)儀580 nm 波長下的吸光度值。相關(guān)系數(shù)R2=0.925 7 與調(diào)整確定系數(shù)接近，均大于0.9，說明擬合程度較好，該響應(yīng)曲面模型中95.36%的吸光度值變化來自A、B、C、D4 個自變量的影響。A、B、C、D4 個因素對580 nm 波長條件下吸光度值的影響均比較顯著（P＜0.05），交互項AB、AC、AD、BC、BD對吸光度值的影響均不顯著（P＞0.05），而交互項CD對吸光度值的影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、D2對吸光度值的影響均不顯著（P＞0.05），而二次項C2對吸光度值的影響顯著（P＜0.05）。通過F值和P值的比較得出，A、B、C、D4 個因素對580 nm 波長下吸光度值的影響從大到小依次為ε-聚賴氨酸濃度（C）、茄非可食部分生物堿提取液濃度（D）、納他霉素濃度（A）、乳酸鏈球菌素濃度（B）。

2.2.3 各因素交互作用對響應(yīng)值Y的影響

納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸和茄非可食部分生物堿提取液4 種天然防腐劑濃度之間存在一定的交互作用，各因素間交互作用影響吸光度值的響應(yīng)曲面見圖6 ～圖11。

圖6 納他霉素和乳酸鏈球菌素的交互作用圖

圖7 納他霉素和ε-聚賴氨酸的交互作用圖

圖8 納他霉素和茄非可食部分生物堿提取液的交互作用圖

圖9 乳酸鏈球菌素和ε-聚賴氨酸的交互作用圖

圖10 乳酸鏈球菌素和茄非可食部分生物堿提取液的交互作用圖

圖11 ε-聚賴氨酸和茄非可食部分生物堿提取液的交互作用圖

由圖6 ～圖11 可知，ε-聚賴氨酸濃度和茄非可食部分生物堿提取液濃度兩因素的交互作用對吸光度值有顯著影響，其他因素間的交互作用不顯著。

2.3 復(fù)配防腐劑配方的確定

通過Expert Design v13.0.5.0 軟件分析，可以得出復(fù)配天然防腐最佳配方為納他霉素濃度0.078 g·kg-1、乳酸鏈球菌素濃度0.080 g·kg-1、ε-聚賴氨酸濃度0.060 g·kg-1、茄非可食部分生物堿提取液濃度14%，此時吸光度值最小，為0.318，抑菌效果最佳，4 種防腐劑比例之和為98%，滿足“防腐劑混合使用時，各自用量占其最大使用量的比例之和不超過1”的原則。按照此組合進行驗證試驗，測定580 nm 波長下的吸光度值為0.333，與理論值的相對誤差為4.50%（＜5%），無顯著誤差，因此試驗結(jié)果與回歸模型擬合度較好，該模型可信度高。

2.4 復(fù)配天然防腐劑的抑菌能力驗證

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）及《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）分別測定霉菌總數(shù)和菌落總數(shù)，具體見表4。0.080 g·kg-1、ε-聚賴氨酸濃度為0.060 g·kg-1、茄非可食部分生物堿提取液濃度為14%時，復(fù)配防腐劑的抑菌效果最佳。本研究為茄非可食部分的開發(fā)利用、變廢為寶提供了良好的借鑒。隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，復(fù)配天然防腐劑的研發(fā)應(yīng)用將有更加廣闊的發(fā)展空間[10]。

表4 復(fù)合天然防腐劑在焙烤食品中應(yīng)用的防腐作用微生物指標(biāo)評價表

由表4 可知，對照組和試驗組的菌落總數(shù)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，小于104CFU·g-1，且對照組的菌落總數(shù)明顯多于試驗組；對照組的霉菌總數(shù)超過規(guī)定的國家標(biāo)準(zhǔn)，即大于150 CFU·g-1，而試驗組未檢出霉菌。

3 結(jié)論

本研究以納他霉素、乳酸鏈球菌素、ε-聚賴氨酸和茄非可食部分生物堿提取液為主要原料，采用單因素試驗和響應(yīng)面試驗分析，確定焙烤食品復(fù)配防腐劑最佳配比，并對該配方進行驗證試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納他霉素濃度為0.078 g·kg-1、乳酸鏈球菌素濃度為