微生物檢測實驗室環境菌庫的建立及分析

◎ 詹 清，周阿容，林夢丹，揭小玲，鄭孝賢，王海龍，方東升

（福建省微生物研究所，福建 福州 350007）

微生物檢測實驗室是否能避免潛在生物污染是其質量評估的重要指標之一[1]，一旦檢測環境發生微生物污染可能會造成檢測結果不準確，檢測機構在檢出樣品微生物超標或致病微生物污染時往往出現溯源難、應變慢等問題，因此檢測機構應監測、控制環境條件，最大限度地降低微生物污染以保證檢測結果的準確性[2]。王似錦等[3]提出了環境分離菌更能夠反映樣品或環境實際存在微生物的情況，利用環境分離菌可使檢測結果對樣品質量做出更客觀和科學的評價。因此了解微生物檢測環境的微生物負載情況，建立檢測環境的微生物信息庫，構建環境微生物分布圖，對于檢測機構排除實驗過程中的污染隱患、減少假陽性微生物干擾和提高檢測結果公信力具有重要意義[4]。目前，國內對藥品生產和檢驗環境建立環境菌庫方面的研究較多。例如，劉亞茹等[5]采用分子生物學鑒定方法對5 家制藥企業潔凈區微生物群落進行鑒定和分析，但在微生物檢測實驗室建立環境微生物菌庫的研究相對較少。

本研究通過采集福建省微生物研究所（以下簡稱研究所）分析測試中心微生物檢測實驗室的環境微生物，結合微生物形態學特征與分子生物學技術對微生物進行鑒定和分類，初步構建了研究所分析測試中心微生物檢測實驗室的環境菌株信息庫，為今后本實驗室檢測結果的溯源提供了方向，對檢測實驗室的污染控制和風險評估具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

胰酪胨大豆瓊脂培養基、葡萄糖沙氏瓊脂培養基（廣東省環凱微生物科技有限公司）；PCR 引物、2×TaqPCR Master Mix（生工生物工程股份有限公司）；TSINGKE 植物DNA 提取試劑盒（通用型，貨號：TSP 101，擎科生物科技有限公司）。

細菌采用16S rDNA 通用引物27 F 和1492 R，真菌采用引物ITS 1 和ITS 4，以上引物均購于生工生物工程股份有限公司，引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.2 儀器

FKC-III 浮游菌采樣器（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；PCR 儀（Biometra）；電泳儀（上海百賽生物技術有限公司）；HVE-50 高壓蒸滅菌鍋（HIRAYAMA）；MIR-154-PC 低溫恒溫培養箱（松下健康醫療器械株式會社）；CX 31 生物顯微（OLYMPUS）；NVT 6201ZH 電子天平[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；SW-CJ-1CU 潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣與培養

依據《醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法》（GB/T 16293—2010）和《醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法》（GB/T 16294—2010）[6-7]布置采樣點，連續12 個月對微生物檢測實驗室的不同部位和檢測人員，分別通過浮游菌采樣器法（采集環境浮游微生物）、空氣沉降法（采集環境沉降微生物）和接觸碟取樣法（采集檢測人員攜帶微生物）進行樣本采集。采集完成后將樣本置于 37 ℃和28 ℃恒溫培養箱中，分別培養48 h 和5 d。

1.3.2 分離純化

用無菌接種環挑取平板中非真菌菌落至TSA 平板，真菌菌落至SDA 平板分別進行兩次以上平板劃線分離純化。

1.3.3 微生物鑒定

分離的微生物經純化后進行革蘭氏染色涂片鏡檢，初步判斷所得菌株類型后采用分子生物學方法對菌株進行鑒定。

（1）基因組提取。用接種環取一環細菌，用50 μL雙蒸水懸浮成液，振蕩混勻后，放置在PCR 儀中，99 ℃加熱15 min；6 000 r·min-1離心10 min 后取上清液，作為后續PCR 反應體系的DNA 模板。依據TSINGK 植物DNA 提取試劑盒（通用型）產品說明書提取真菌基因組。

（2）PCR 反應體系。DNA 模板5 μL，正反引物各2 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，用雙蒸水補齊體系至50 μL。

（3）PCR 反應條件。95 ℃預變性，5 min；95 ℃變性，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，1 min；循環35 次；72 ℃后延伸，10 min；10 ℃暫存。

（4）擴增產物測序及比對。將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，選取電泳結果中條帶單一、明亮的擴增產物送往鉑尚生物股份有限公司進行測序，將測序序列結果在NCBI 網站上進行Blast 同源性比對，取同源性在98.65%以上的結果作為比對結果[8]。

2 結果與分析

2.1 環境微生物分布

2.1.1 時間分布情況

本研究連續12 個月對微生物檢測實驗室不同部位和檢測人員進行了樣本采集，每個月采集的菌株數如圖1 所示。其中第一季度平均采集到73 株菌，第二季度平均采集到103 株菌，第三季度平均采集到98 株菌，第四季度平均采集到88 株菌。

圖1 不同時間收集菌株數統計圖

2.1.2 區域分布情況

通過連續12 個月的樣本采集發現，不同月份的環境菌數量有所不同，但是種類并無顯著差別，9 月采集到的環境菌數量最多，共收集到109 株環境菌，詳見表2。其中非受控區域共采集到58 株菌，占全部菌株的53.21%；潔凈室共采集到36 株菌，占全部菌株的33.03%；從檢測人員身上共采集到15 株菌，占全部菌株的13.76%。

表2 9 月份樣本采集各區域菌株分布情況表

2.2 菌株鑒定結果

結合微生物菌落形態和結構特征，對采集到的不同菌株進行16S rDNA 測序鑒定，根據鑒定結果將采集到的菌株分為7 個屬，其中數量最多的葡萄球菌屬占37.61%，芽孢桿菌屬和微球菌屬分別占24.77%和13.76%。詳見表3。

表3 分離菌株的菌屬分布及數量表

2.3 環境菌信息庫的建立

根據采集到環境菌的培養特性、形態結構以及測序比對結果，將收集到的環境微生物進行歸納總結，詳見表4。

表4 環境菌信息統計表

3 結論與討論

從連續12 個月采集獲得菌株的結果分析，3—4 月采集獲得的真菌數量較多，經分析認為，3—4 月為當地的梅雨季節，自然環境空氣濕度較高，檢測實驗室環境濕度高于設定的限值，容易導致真菌繁殖，主要為曲霉菌屬和青霉菌屬，這兩類真菌均能產生孢子，能在室內空氣和灰塵中存活。因此在每年濕度較高的季節應注意控制潔凈室的濕度，同時增加潔凈室清潔消毒的頻率，及時清潔與更換潔凈區空氣過濾器。9—10 月檢測人員進出潔凈室較為頻繁，采集獲得的細菌數量也較多，容易在人類皮膚上棲居的微生物，如葡萄球菌屬和微球菌屬在多個采樣點均有發現，分析可能是由于檢測人員的頻繁活動或接觸造成的污染。這也表明，檢測人員身上容易攜帶的微生物是微生物檢測實驗室環境菌的主要來源之一，這與國內外相關報道基本一致[9-11]。因此，為降低人為污染的風險，應嚴格控制潔凈區人員數量，強化檢測人員的無菌意識，避免過多接觸物料，規范進入潔凈區的人員操作和清潔程序，同時在檢測活動頻繁時要及時制定更高頻率的清潔消毒程序。從采集獲得菌株的結果分析得知，檢測環境中還存在多種芽孢桿菌，可選擇消殺效能高的消毒劑，從而達到控制潛在污染微生物的風險。本研究通過連續12 個月對實驗室不同部位進行采樣收集，初步建立了研究所微生物檢測實驗室的環境菌庫，但是建立環境菌庫是一個動態管理的過程，后期需要進行日常監測追蹤，不斷更新和完善環境菌庫溯源體系，當出現趨勢變化或異常情況應及時采取有效整改措施。