螺螄肉湯包的DNA提取方法效果比較及優化研究

◎ 黃曉韻，楊麗玉，巫 堅

（1.廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西 南寧 530029；2.廣西醫科大學 公共衛生學院，廣西 南寧 530021）

隨著生活水平的提高，人們對食品安全及其質量越來越重視。特別是在深加工食品領域，由于復雜的加工工藝，摻偽、轉基因成分、過敏原性成分等的檢測問題越來越突出。基于核酸的分子生物學檢測方法具有高特異性、高靈敏度和簡單快速等特點，被廣泛應用到深加工食品源性成分鑒定等檢測中。深加工食品加工過程中多種因素會對核酸造成破壞[1]，且內含成分復雜，造成核酸提取難度加大。因而，深加工食品的核酸提取一直是研究的難點及熱點[2]。

柳州螺螄粉以其獨特的風味在最近幾年迅速走紅，其中獨特的“鮮”味來源于螺螄肉湯包。《食品安全地方標準 柳州螺螄粉》（DBS 45/034—2021）中規定，螺螄肉湯料包是以鮮（凍）螺螄或螺螄肉、鮮（凍）畜骨或禽骨、食用鹽、食用油脂（或不添加）、調味料等為原料，經原料預處理、加水熬制、過濾、冷卻（或不冷卻）、包裝、殺菌（或不殺菌）等工藝加工制成的。其中，螺螄主要包括環棱螺屬（Bellamya）和圓田螺屬（Cipangopaludina）等淡水經濟螺類，畜骨或禽骨也沒有明確的種類，動物源性成分不明；甚至各種調味料還可能涉及轉基因成分或過敏原性成分。基于核酸分子特別是脫氧核糖核酸（Deoxyribo Nucleic Acid，DNA）分子的檢測方法，在鑒定源性成分領域具有獨特的優勢[3]。近年來得到廣泛應用的有聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術[4]、實時熒光PCR（Quantitative Real-Time PCR，qPCR）技術[5]和數字PCR（Digital PCR，dPCR）技術[6]。

螺螄肉湯包內含物成分復雜，多油脂、鹽類和色素，且經高溫熬制，對核酸分子破壞嚴重。本研究通過比較分析常用的核酸提取方法，優化改良適合類似深加工食品的核酸提取方法，盡量去除雜質干擾，得到能進行下一步分子檢測的有效核酸，為湯料包內含物源性成分的分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

預包裝螺螄粉，均為市售。

十二烷基硫酸鈉（SDS）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA）、乙酸鉀、3 mol·L-1乙酸鈉、苯酚（Tris-飽和酚）及核酸抽提液（三氯甲烷和異戊醇的體積比為24 ∶1）：北京索萊寶科技有限公司產品；蛋白酶K：寶生物工程（大連）有限公司產品；食品DNA 提取試劑盒：德國凱杰（QIAGEN）公司產品；深加工食品DNA 提取試劑盒、熒光PCR 試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司產品。

1.2 儀器與設備

OSE-DB-03 型恒溫振蕩金屬浴、OSE-260-01TGem Plus 型全波長微量分光光度計：天根生化科技（北京）有限公司產品；MIKPO185 型小型離心機：德國赫提馳科學儀器公司產品；Applied Biosystems 7500 Fast 實時熒光定量PCR 儀：美國應用生物系統公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA 提取方法

（1）CTAB 法提取DNA。 參考標準《 肉及肉制品中動物源性成分的測定 實時熒光PCR 法》（SB/T 10923—2012）中樣品的總DNA 提取方法。

（2）SDS 法提取DNA。參考《轉基因動物及其產品成分檢測 DNA 提取和純化》（農業部2406 號公告-7-2016）中樣品的總DNA 提取方法。

（3）TIANGEN 沉淀式DNA 提取試劑盒（以下簡稱TIANGEN 試劑盒）提取DNA。參考天根生化科技（北京）有限公司的深加工食品DNA 提取試劑盒的操作說明書進行試驗。

（4）QIAGEN 過柱式DNA 提取試劑盒（以下簡稱QIAGEN 試劑盒）提取DNA。參考德國凱杰（QIAGEN）食品DNA提取試劑盒的操作說明進行試驗。

（5）改良CTAB 法提取DNA。吸取混勻的1.5 mL螺螄肉湯包樣品液于2 mL EP 管中，8 000 r·min-1離心5 min，用一次性無菌脫脂棉簽小心刮去凝結浮在上層的油脂，保留沉淀物。加入1 mL 無菌雙蒸水，渦旋振蕩洗滌，12 000 r·min-1離心5 min 后棄上清。再次用一次性無菌脫脂棉簽小心刮去凝結浮在上層的油脂，保留沉淀物。重復上述流程，直至離心后上層無明顯油脂且洗滌的液體顏色基本褪色變淡。向所得沉淀中加入700 μL DNA 提取裂解液，再加入20 μL蛋白酶K，混勻，置于65 ℃水浴3 h，并不時振蕩；12 000 r·min-1離心5 min，取上清液至新的1.5 mL 離心管中，加入等體積苯酚，充分混勻后12 000 r·min-1離心5 min；取上清，加入等體積核酸抽提液，充分混勻，12 000 r·min-1離心5 min；取上清，加入1/10 體積的3 mol·L-1乙酸鈉溶液，混勻后再加入2 倍體積-20 ℃預冷的無水乙醇，-20 ℃下靜置1 h，12 000 r·min-1離心5 min，棄上清；70%乙醇洗滌3 次沉淀，于室溫下晾干，加入50 μL 雙蒸水溶解沉淀，-20 ℃保存備用。

1.3.2 螺螄肉湯包中DNA 提取效果比較分析

（1）DNA 的濃度和純度測定分析。吸取1 μL DNA樣液，使用全波長微量分光光度計測定DNA 的質量濃度與純度。在儀器上可直接讀出DNA 的質量濃度以及A260/A280和A260/A230的值。根據A260/A280和A260/A230的值判斷所提取的基因組DNA 的純度，其中A260/A280表示DNA 中去除蛋白質和酚物質的情況，A260/A230的值表示DNA 中去除碳水化合物或有機溶劑的情況[7]。

（2）實時熒光PCR 上機檢測提取DNA 的有效性。參考《常見畜禽動物源性成分檢測方法 實時熒光PCR 法》（GB/T 38164—2019）中的18S rRNA 基因內參引物探針，上機檢測提取DNA 是否有效滿足下游分子檢測需要。其中上游引物序列為TCTGCCCTATC AACTTTCGATGGTA，下游引物序列為AATTTGCGC GCCTGCTGCCTTCCTT，熒光探針序列5’FAM-CCG TTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-3’TAMRA。

實時熒光PCR 總反應體系為20 μL，體系組成為PCR Master Mix 10 μL，模板DNA 5 μL（稀釋到5～50 ng·μL-1），內參引物的上下游引物各0.6 μL，熒光探針0.4 μL，加雙蒸水至20 μL。實時熒光PCR 擴增程序為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min 并收集熒光，40 次循環。

2 結果與分析

2.1 DNA 提取效果比較

2.1.1 DNA 濃度和純度的比較

用同一包預包裝螺螄粉的螺螄肉湯包，分別按照1.3.1 中的（1）～（4）4 種方法平行提取DNA 兩份，用全波長微量分光光度計測定DNA 的質量濃度和純度，如表1 所示。

表1 4 種不同DNA 提取方法對螺螄肉湯包樣品的DNA 提取效果比較表

本試驗采用的4 種方法取樣量均相同，經儀器測定可直接比較DNA 的質量濃度。4 種提取方法中TIANGEN 試劑盒法提取得到的DNA 質量濃度最高，其次分別是CTAB 法和SDS 法，QIAGEN 試劑盒最低。4 種提取方法的DNA 提取濃度平均值之間最大相差近66 倍，說明不同提取方法分離純化湯包中總DNA 的效率有較大差異。TIANGEN 試劑盒法使用的是沉淀法，裂解上清液損失最少，這可能是該方法DNA 提取濃度最大的原因；雖然QIAGEN 試劑盒法也使用了蛋白酶K 輔助裂解組織，但螺螄肉湯包的原料在經過復雜加工后，核酸被破壞嚴重，特別是被打斷短小化，所以使用過柱吸附DNA 的方式損失量較大，這可能是該方法DNA 提取濃度最小的原因。

一般來說，理想DNA 的A260/A280值在1.6 ～2.0，小于1.6 表明有蛋白質污染，大于2.0 可能有RNA 污染；A260/A230值在2.0 左右，小于2.0 可能存在鹽類及其他有機化合物的污染。如表1 所示，4 種不同DNA提取方法提取得到的總DNA 的純度差別較大。其中，CTAB 法的A260/A280值更接近1.6，蛋白質的去除較好，但還有提高的空間；其他3 種方法的A260/A280值相對較低。4 種提取方法的A260/A230值普遍較低，螺螄肉湯包的湯料含有大量的油脂沒有被去除，其可能會與某些鹽離子吸附，DNA 中鹽類雜質殘留較多，在230 nm處亦有較高的吸收值，使得A260/A230值降低。

2.1.2 DNA 有效性的比較

以18S rRNA 基因內參引物探針進行實時熒光PCR 擴增試驗。當熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct 值≤30.0，表明提取得到的DNA的濃度及純度基本滿足分子檢測擴增試驗的要求。對4 種方法提取得到的DNA 進行實時熒光PCR 擴增，其擴增曲線圖譜及擴增效果如圖1 和表2 所示。

①～⑧的擴增曲線分別表示相對應的提取序號。圖1 4種DNA 提取方法提取的DNA 樣液實時熒光PCR 擴增曲線圖

表2 4 種DNA 提取方法提取的DNA 樣液實時熒光PCR 擴增效果表

結合圖1 及表2，可見CTAB 法、SDS 法和QIAGEN試劑盒法所提取的總DNA 以18S rRNA 基因內參引物探針進行實時熒光PCR 擴增試驗時均有較好的熒光擴增曲線，且Ct 值均在30.0 以內，即表明以上3 種方法提取的DNA 是有效可行的。其中CTAB 法提取的總DNA 擴增的Ct 值最低，效果最好。TIANGEN 試劑盒法所提取的總DNA 未檢測到有效熒光，可能是提取得到的DNA 中雜質較多，含有抑制熒光擴增的物質。

2.2 改良CTAB 法提取螺螄肉湯包中DNA 的效果及分析

螺螄肉湯包包含了大量的鹽類、脂肪以及色素等物質，嚴重降低提取DNA 的效果。針對前述4 種提取DNA 方法的結果，選取初步提取效果較好的CTAB法進行改良。在加入裂解提取液前，用無菌雙蒸水多次洗滌沉淀，去除水溶性的鹽類及色素，同時脂肪由于離心作用凝結浮在液體上層，可用無菌脫脂棉簽去除。此外，由于提取的DNA 的A260/A230值普遍較低，所以在乙醇沉淀DNA 后用70%乙醇洗滌時，增加兩次洗滌，盡量去除殘留鹽類等雜質。經相同取樣，按照改良CTAB 法提取的DNA 的質量濃度如表3 所示。對改良CTAB 法提取的DNA 進行實時熒光PCR 上機檢測，有效性如圖2 及表4 所示。

①和②的擴增曲線分別表示相對應的提取重復序號。圖2 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實時熒光PCR 擴增曲線圖

表3 改良CTAB 法對螺螄肉湯包樣品的DNA 提取效果比較表

表4 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實時熒光PCR 擴增效果表

結合表1 及表3 可知，CTAB 法經改良后，提取DNA 的A260/A280值明顯提高且在正常范圍內，表明提取過程中蛋白質去除比較徹底。這可能是因為在加入蛋白酶K 恒溫酶解前用無菌雙蒸水去除湯包中的雜質，特別是水溶性的鹽類以及脂肪，減少了抑制蛋白酶K 酶活的物質，提高了酶解效率。這也從最后的質量濃度提高了接近一倍得到佐證。此外，改良CTAB法由于在加入提取裂解液前用無菌雙蒸水去除湯包中的雜質，特別是水溶性的鹽類以及脂肪，使得最后A260/A230值大大提高。雖然還達不到理想值，但實時熒光PCR 上機檢測結果表明其完全滿足后續分子檢測擴增試驗的要求，改良提取方法后，降低了Ct 值（表4）。

2.3 多批次不同品牌預包裝螺螄粉螺螄肉湯包中DNA的提取及效果分析

按照改良CTAB 法對多批次不同品牌預包裝螺螄粉螺肉湯包中的DNA 進行提取，對得到的DNA 進行實時熒光PCR 效果分析，結果見圖3 和表5。改良后的CTAB 法提取多批次不同品牌實際樣品DNA 的效果良好，DNA 的濃度和純度滿足實時熒光PCR 要求，且有典型擴增曲線，各樣品的擴增Ct 值在16.045 ～26.116，適宜進行下一步物源性成分分子檢測。

表5 改良CTAB 法提取的DNA 樣液實時熒光PCR 擴增效果表

3 結語

湯料包類深加工食品內含成分既包含動物源性成分，也包含植物源性成分，在食品安全監管中對源性成分的檢測還是空白。這是因為這類深加工食品工藝復雜，對其中的成分物質破壞嚴重，如特征蛋白質完全變性；同時各種成分物質含量較少，傳統檢測方法無法對微量成分進行檢測。基于核酸物質的分子檢測方法可以彌補傳統檢測方法的缺點，但是必須提取到有效可行的核酸。本研究針對預包裝柳州螺螄粉螺螄肉湯包，比較了4 種常見DNA 提取方法的提取效果，選取提取效果較好的CTAB 法進行改良，通過真核生物通用18S rRNA 內參基因設計的引物探針進行實時熒光PCR 驗證提取效果，并進一步用多批次實際樣品進行提取DNA 上機確認，成功尋找到一種簡單、快捷、可行的提取預包裝柳州螺螄粉中螺螄肉湯包DNA 的方法，為下一步的源性成分鑒定奠定基礎。