GC-MS/MS 法測(cè)定蘋果中乙螨唑含量的不確定度評(píng)定

◎ 張丹丹，李國(guó)輝，唐德紅，李 梅

（1.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義 563000；2.遵義師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，貴州 遵義 563006）

乙螨唑（Etoxazole）隸屬于二苯基惡唑啉殺蟲(chóng)劑[1-2]，具有觸殺和胃毒作用，對(duì)螨卵胚胎的形成有較好的抑制作用，還能阻礙幼螨到成螨的蛻皮過(guò)程。乙螨唑因具有活性高、持效期長(zhǎng)、滲透力強(qiáng)、耐雨水沖刷等特點(diǎn)，對(duì)二斑葉螨、山楂葉螨、紅蜘蛛、茶黃螨、朱砂葉螨等有較好防治效果[3-8]。但其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的頻繁使用會(huì)導(dǎo)致不同程度的農(nóng)藥殘留。乙螨唑具有生物富集和非靶向毒性[9]，可損害人體細(xì)胞的正常生理功能[10]，在農(nóng)作物上的殘留量過(guò)高會(huì)給人體健康帶來(lái)安全隱患。《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）[11]對(duì)蘋果中乙螨唑殘留限量值有明確的規(guī)定，即不能超過(guò)0.1 mg·kg-1。

一份完整的定量報(bào)告包括測(cè)量值及其測(cè)量不確定度[12-13]。測(cè)量不確定度與實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果緊密關(guān)聯(lián)[14-15]，在評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度方面發(fā)揮著重要作用，能為測(cè)定結(jié)果提供更加科學(xué)的保障[16-17]。不確定度數(shù)值越小，說(shuō)明測(cè)量結(jié)果越準(zhǔn)確，測(cè)量結(jié)果越接近真值。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行不確定度評(píng)定是一項(xiàng)必不可少的工作，不僅可以為臨界值提供數(shù)據(jù)支撐，降低誤判風(fēng)險(xiǎn)，還有助于實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)內(nèi)部質(zhì)量控制[18-22]。

本文根據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.113—2018）對(duì)蘋果中乙螨唑殘留量進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量。同時(shí)參考測(cè)量不確定度評(píng)定及表示的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[23-26]建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)乙螨唑殘留量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)定，明確影響測(cè)定結(jié)果的主要因素，以便在日后的檢驗(yàn)工作中對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，進(jìn)一步提升檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、乙酸乙酯，色譜純，阿達(dá)瑪斯試劑（中國(guó)）公司；氯化鈉，分析純，廣東云星生物技術(shù)有限公司；硫酸鎂，分析純，天津市華盛化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸鈉，分析純，上海普譽(yù)科貿(mào)有限公司；檸檬酸氫二鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司；乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)品：100 μg·mL-1，不確定度0.15 μg·mL-1，溶劑為甲醇，農(nóng)業(yè)部農(nóng)村環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。

蘋果，采購(gòu)于遵義市任家坳農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

8890-7000D 氣質(zhì)聯(lián)用儀（EI 源），美國(guó)Agilent公司；電子天平（ME204E），瑞士梅特勒-托利多（上海）有限公司；HT-200 多管旋渦混勻儀，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；SIGMR 3-18KS 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；YDCY-12L 水浴氮吹儀，上海熙揚(yáng)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

按照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中208 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.113—2018）中方法進(jìn)行樣品提取和凈化，外標(biāo)法定量。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確移取乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mL至25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀釋并定容，配成質(zhì)量濃度為4 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。依次準(zhǔn)確移取一定量的乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙酸乙酯定容，得到濃度分別為0.10 μg·mL-1、0.12 μg·mL-1、0.16 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.24 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

將空白蘋果樣品按GB 23200.113—2018 中方法處理至氮吹近干，再分別準(zhǔn)確加入不同濃度的乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL 復(fù)溶，得到質(zhì)量濃度分別為0.10 μg·mL-1、0.12 μg·mL-1、0.16 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.24 μg·mL-1的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待用。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相條件。ThermoTG-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：300 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；載氣：高純氦氣；流速：1.2 mL·min-1；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。升溫程序見(jiàn)表1。

表1 升溫程序表

（2）質(zhì)譜條件。離子源：EI 源；電子能量：70 eV；接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；溶劑延遲時(shí)間：5 min。掃描方式：MRM 模式。乙螨唑定量離子對(duì)141.0/113.0，碰撞電壓15 V；定性離子對(duì)141.1/63.1，碰撞電壓30 V；定性離子對(duì)204.0/176.1，碰撞電壓10 V；定性離子對(duì)299.9/269.9，碰撞電壓20V。

1.4 數(shù)學(xué)模型

蘋果中乙螨唑含量按照公式（1）計(jì)算。

式中：X為試樣中乙螨唑的含量，mg·kg-1；C為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品待測(cè)液中乙螨唑的質(zhì)量濃度，μg·mL-1；V為待測(cè)液定容體積，mL；V1為提取溶液的體積，mL；V2為分取溶液體積，mL；m為稱取蘋果試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

參考整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程并結(jié)合數(shù)學(xué)模型分析，氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）測(cè)定蘋果中乙螨唑含量的過(guò)程中引入的不確定度來(lái)源有乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、樣品稱量、樣品待測(cè)液制備、測(cè)量重復(fù)性、回收率。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度u(S)

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S1)

查閱乙螨唑標(biāo)物證書，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1，擴(kuò)展不確定度為0.15 μg·mL-1，按矩形分布計(jì)算，由乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S2)

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液在配制過(guò)程中用到了A 級(jí)1 mL 單標(biāo)線吸量管、25 mL 容量瓶。1 mL 單標(biāo)線吸量管和25 mL 容量瓶對(duì)應(yīng)的容量允差分別為±0.007 mL和±0.03 mL[26]。按照矩形分布考慮，，則1 mL 單標(biāo)線吸量管和25 mL 容量瓶的容量允差引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

因玻璃量器（硼硅玻璃體積膨脹系數(shù)為1.0×10-5℃-1）與溶劑隨溫度變化而產(chǎn)生的體積變化相比，可忽略不計(jì)，只需考慮后者引入的不確定度。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為（20±5）℃時(shí)，甲醇和乙酸乙酯的體積膨脹系數(shù)分別為1.19×10-3℃-1、1.38×10-3℃-1。依照矩形分布考慮，，則1 mL 單標(biāo)線吸量管和25 mL 容量瓶因環(huán)境溫度改變而引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

因此，在標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程中，由1 mL 單標(biāo)線吸量管和25 mL 容量瓶引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為

合成得乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.1.3 試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S3)

試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過(guò)程中用1 mL 刻度吸量管和10 mL 容量瓶稀釋并定容，不確定度按2.1.2 評(píng)定方法進(jìn)行評(píng)定，不確定度結(jié)果詳見(jiàn)表2。表2 中的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量互不相關(guān)，則試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表2 玻璃量器及溫度變化引入的不確定度表

2.1.4 基質(zhì)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S4)

基質(zhì)工作溶液配制過(guò)程使用1 mL 單標(biāo)線吸量管（A 級(jí)）5 次，不確定度參考2.1.2 評(píng)定過(guò)程。蘋果空白基質(zhì)溶液體積膨脹系數(shù)參考乙酸乙酯，當(dāng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度為（20±5）℃時(shí)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

以上各項(xiàng)不確定度分量互不相關(guān)，合成乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Cal)

對(duì)空白基質(zhì)配制的5 個(gè)不同濃度點(diǎn)的乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度點(diǎn)平行測(cè)定3 次。以乙螨唑質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到回歸方程為Y=1 597 291.463C-129 7，r=0.999。乙螨唑基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的測(cè)試數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表3。

表3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)表

對(duì)蘋果陽(yáng)性試樣測(cè)定7 次，得出蘋果試樣中乙螨唑的質(zhì)量濃度分別為0.197 7 μg·mL-1、0.196 5 μg·mL-1、0.192 6 μg·mL-1、0.198 8 μg·mL-1、0.194 8 μg·mL-1、0.193 4 μg·mL-1和0.192 9 μg·mL-1，則標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算為

式中：S(A)為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差；Yfi為乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液不同濃度級(jí)別點(diǎn)峰面積實(shí)際響應(yīng)值；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；Ci為不同濃度級(jí)別乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液理論質(zhì)量濃度，μg·mL-1；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；n為乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)（5 水平×3 平行=15）；p為樣品溶液平行測(cè)定次數(shù)，p=7；C0為待測(cè)試樣通過(guò)校準(zhǔn)曲線所得的濃度平均值，0.195 2 μg·mL-1；C-為不同濃度級(jí)別乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均值，0.164 μg·mL-1；Cfi為乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)測(cè)濃度，μg·mL-1。

將表3 數(shù)據(jù)帶入公式（3）中計(jì)算得S(A)=3 881.64，u(Cal)=0.001 176 μg·mL-1，則標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.3 樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

查看天平檢定證書，其允許誤差為±0.5 mg（即±0.000 5 g）。依照矩形分布計(jì)算，樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 樣品待測(cè)液制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Q)

提取過(guò)程中采用10 mL 單標(biāo)線吸量管移取10 mL乙腈加至樣品中。A 級(jí)10 mL 單標(biāo)線吸量管容量允差為±0.020 mL[26]，在（20±5）℃時(shí)乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，不確定度評(píng)定參考2.1.2，則10 mL單標(biāo)線吸量管引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

分取樣液時(shí)，用2 mL 單標(biāo)線吸量管吸取離心上清液2 mL，A 級(jí)2 mL 單標(biāo)線吸量管容量允差為±0.010 mL[26]。因此，分取過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

定容時(shí)，用A 級(jí)1 mL 單標(biāo)線吸量管吸取1 mL 乙酸乙酯，則定容過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

以上3 個(gè)不確定度分量互不相關(guān)，則樣品待測(cè)液制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)

添加4 μg·mL-1乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25 mL 到空白蘋果樣品中，按1.3.1 方法處理，進(jìn)行7 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。樣品7 次重復(fù)測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S(X)依據(jù)計(jì)算，測(cè)量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為，詳細(xì)測(cè)定和計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

樣品測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 加標(biāo)回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

蘋果試樣在前處理過(guò)程中可能會(huì)引起乙螨唑的部分損失，導(dǎo)致試樣中的乙螨唑無(wú)法全部進(jìn)入儀器進(jìn)行檢測(cè)。在空白蘋果試樣中添加一定量的乙螨唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，加標(biāo)量為0.1 mg·kg-1，按1.3.1 處理方法，進(jìn)行7 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定計(jì)算，回收率結(jié)果依次為98.9%、98.3%、96.4%、99.4%、97.4%、96.7%、96.4%，平均回收率為97.6%。

回收率的標(biāo)準(zhǔn)偏差為

則回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

采用t檢驗(yàn)考察平均回收率與100%之間的差異是否顯著。當(dāng)n=7，即自由度為6，置信概率為95%時(shí)，t(0.05,6)=2.447。當(dāng)平均回收率=97.6%時(shí)，t=|100%-97.6%|/0.467%=5.14，t＞2.447，需要用回收率對(duì)結(jié)果進(jìn)行修正。則由回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.7 合成不確定度

蘋果中乙螨唑的各個(gè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量信息見(jiàn)表5，根據(jù)各分量數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算乙螨唑的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表5 測(cè)定過(guò)程中各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

蘋果樣品中乙螨唑殘留量平均值為0.097 5 mg·kg-1，則乙螨唑合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.8 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果表示

在95%置信概率條件下，取k=2，擴(kuò)展不確定度U=u×k=0.003 62×2=0.007 2 mg·kg-1，蘋果中乙螨唑含量的結(jié)果可表示為（0.097 5±0.007 2）mg·kg-1，k=2。

3 結(jié)論

本研究采用GC-MS/MS 結(jié)合外標(biāo)法對(duì)蘋果中乙螨唑含量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)建立不確定度數(shù)學(xué)測(cè)量模型，對(duì)可能影響最終測(cè)定結(jié)果的不確定度分量進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試劑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制、基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制引入的不確定度較大，而試樣稱量過(guò)程引入的不確定度則較小。因此，在日常檢驗(yàn)工作中，應(yīng)根據(jù)樣品的實(shí)際濃度選擇適宜的工作曲線范圍以及合適的量具，定期對(duì)量具進(jìn)行檢定校準(zhǔn)，減小實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫差波動(dòng)范圍等，以降低檢測(cè)結(jié)果的不確定度，提升測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。