石仙桃黃酮-多糖抑制鮮切蘋果褐變的研究

◎ 李卓穎，鄭圣樂，曾俊軒，陳曉瑩，房美彤，馬娟娟

（廣州工商學院，廣東 佛山 528138）

石仙桃（Pholidota chinensisLindl.），別名石橄欖、石上仙桃、石山蓮等，為蘭科石仙桃屬植物。石仙桃為藥食兩用食材，主要化學成分為黃酮類、多糖、萜類、酚類、脂肪族以及菲類等，藥理活性優越[1-2]。石仙桃有養陰潤肺、利濕消淤的功效，醫學上可以用于治療肺熱咳嗽、咽喉腫痛、風濕疼痛等疾病[3]。目前，石仙桃中黃酮的提取方法主要有閃式提取法[4]、乙醇回流提取法[5]、超聲波輔助提取法[6]、微波輔助提取法[7]等，提取多糖則多為水浸取法。現有的提取方法存在耗時長、提取率低、操作復雜等不足，最重要的是不能高效提取石仙桃的化學成分，進而導致原料浪費。雙水相是兩種或兩種以上具有一定濃度的親水性溶液混合后靜置呈現互不相溶的兩相的系統[8]。依據物質在兩相間分配系數的不同可進行雙水相萃取分離，具有實驗環境溫和、操作簡便、經濟省時、易于放大、萃取高效等優點，可應用于天然產物中活性成分的萃取[9]。

石仙桃作為藥食同源原料，具有豐富的營養與藥用價值，石仙桃提取物的開發利用對保障人們身體健康有積極作用。研究石仙桃黃酮、多糖的提取有利于天然藥物化學的研究，對天然抗氧化物質和保健功能性食品的開發具有指導意義。本實驗采用雙水相高效提取石仙桃中的黃酮和多糖，拓寬了提取石仙桃中化學成分的方法，提高了石仙桃的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

石仙桃干制品，經60 ℃烘干，磨碎，過60 目篩備用；新鮮蘋果；蘆丁，維克生物科技有限公司；1,1- 二苯基-2- 苦肼基（DPPH）、2,2- 聯氮- 二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS），合肥巴斯夫科技有限公司；聚乙二醇、硫酸銨、葡萄糖、鹽酸、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、3,5-二硝基水楊酸（DNS）、氫氧化鈉和過硫酸鉀（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為去離子水（實驗室自制）。

WF-18 超微粉碎機，溫州頂歷醫療器械有限公司；KS-600D 超聲波儀器，寧波海曙科生超聲設備有限公司；TDL-40B 離心機，上海安亭科學儀器廠；FA2104B 電子天平，上海市安亭電子儀器廠；V-1000分光光度計，翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蘆丁、葡萄糖標準曲線的繪制

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法繪制蘆丁標準曲線。分別精密吸取蘆丁溶液（1 mg·mL-1）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL 和1.0 mL 加入10 mL 容量瓶，以70%乙醇補足1.0 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖晃后靜置6 min；加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL，搖晃后靜置6 min；最后加1 mol·L-1NaOH溶液4 mL，搖晃后放置10 ～15 min，用70%的乙醇定容。用70%乙醇作為空白對照，在510 nm 波長下測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程y=1.558x-0.088 7，R2=0.995。

采用3,5-二硝基水楊酸法繪制葡萄糖標準曲線。分別精密吸取葡萄糖標準液（1 mg·mL-1）0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL于10 mL試管，用蒸餾水補齊1.0 mL，加入1 mL DNS 試劑，于沸水浴鍋中加熱5 min 使溶液完全顯色，后立即將試管置于流動冷水下沖洗迅速冷卻并搖勻，定容至10.0 mL，在540 nm 波長測定吸光度。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線方程y=0.596 5x-0.034 6，R2=0.995 6。

1.2.2 雙水相體系提取石仙桃黃酮和多糖

精準稱取0.5 g 的石仙桃粉末樣品，料液比1 ∶40（g ∶mL）、21% PEG6000、14% (NH4)2SO4，構建雙水相體系，利用超聲波輔助提取，在浸泡溫度60 ℃、超聲時間30 min的條件下提取石仙桃中的黃酮和多糖。提取后對溶液進行離心（4 000 r·min-1，10 min），將上相和下相溶液分別過濾定容，作為待測液。

1.2.3 上相中總黃酮含量的測定

按1.2.1 中蘆丁標準曲線繪制方法測定上相中總黃酮的含量。

1.2.4 下相中多糖含量的測定

（1）還原糖樣品溶液制備。按1.2.2 中的方法制得的下相溶液即為石仙桃還原糖樣品溶液。

（2）總糖樣品溶液制備。精密吸取多糖樣品溶液5 mL 于試管中，加5 mL 6 mol·L-1HCL 溶液，于沸水浴中加熱20 min 顯色，后立即將試管置于流動冷水下沖洗迅速冷卻并搖勻。滴加一滴酚酞指示劑，用6 mol·L-1NaOH 溶液滴定至溶液初呈淡紅色，將溶液移入25 mL 容量瓶，加蒸餾水定容至刻度搖勻，即得石仙桃總糖樣品溶液。

（3）樣品測定。分別精密吸取上述還原糖、總糖樣品溶液各1 mL 于試管，加DNS 試劑1 mL，混合均勻。于沸水浴中加熱5 min 使溶液完全顯色，后立即將試管置于流動冷水下沖洗迅速冷卻并搖勻。在540 nm 波長測定吸光度，代入葡萄糖標準曲線方程計算濃度，并計算石仙桃樣品中還原糖及總糖的含量，最后計算多糖的含量，計算公式為

式中：C1、C2分別為根據葡萄糖標準曲線方程計算得到的還原糖溶液和總糖溶液濃度，mg·mL-1；V1、V2分別為還原糖溶液和總糖溶液的提取體積，mL；n1、n2分別為還原糖溶液和總糖溶液的稀釋倍數。

1.2.5 石仙桃黃酮和多糖的抗氧化活性研究

（1）石仙桃提取物對DPPH 自由基清除能力的測定。將石仙桃提取液稀釋5 個梯度，黃酮濃度水平1 ～5為6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1和100.00 μg·mL-1，多糖濃度水平1 ～5為31.25 μg·mL-1、62.50 μg·mL-1、125.00 μg·mL-1、250.00 μg·mL-1和500.00 μg·mL-1，復配液濃度水平1 ～5為對應1 ～5 黃酮和多糖溶液按1 ∶1 混合，即（6.25+31.25）μg·mL-1、（12.50+62.50）μg·mL-1、（25.00+125.00）μg·mL-1、（50.00+250.00）μg·mL-1、（100.00+500.00）μg·mL-1。將0.5 mL 不同濃度的黃酮、多糖以及復配液分別與2 mL 的DPPH 溶液（0.12 mmol·L-1）混合均勻，避光反應30 min，在517 nm波長下測吸光值A樣品；將0.5 mL 石仙桃提取物與2 mL無水乙醇混勻，避光反應30 min 后測吸光度A對照；將2 mL 的DPPH 溶液和0.5 mL 無水乙醇混勻，避光反應30 min 后測吸光度A空白；根據公式（3）計算石仙桃提取物對DPPH 自由基的清除率。

（2）石仙桃提取物對ABTS 自由基清除能力的測定。樣品處理同上，取2 mL 的ABTS+（7.4 mmol·L-1）溶液和0.2 mL 提取液混勻，室溫避光反應6 min 后在734 nm 波長下測定其吸光值。具體操作同上，根據公式（4）計算石仙桃提取物對ABTS 自由基的清除率。

1.2.6 石仙桃黃酮和多糖對鮮切蘋果褐變的抑制作用研究

（1）樣品預處理。挑選出大小均勻無機械傷的蘋果，洗去表面雜質并晾干。將蘋果去皮，切成均勻的小塊，分別浸泡在蒸餾水、黃酮、多糖及其復配物[黃酮濃度水平1 ～3為25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1和100.00 μg·mL-1，多糖濃度水平1 ～3為125.00 μg·mL-1、250.00 μg·mL-1和500.00 μg·mL-1，復配液濃度水平1 ～3為對應1~3 黃酮和多糖溶液1 ∶1 混合，即（25.00+125.00）μg·mL-1、（50.00+250.00）μg·mL-1、（100.00+500.00）μg·mL-1]中30 min，待表面水分瀝干后，以每袋30 g 的量包裝在真空袋內。每個處理做3 個重復，在第0 天、第1 天、第2 天、第3 天時取樣提取并檢測多酚氧化酶的活性。

（2）多酚氧化酶的提取。精密稱取1.0 g蘋果樣品，加入預冷的磷酸緩沖液（pH=7.0）3 mL，充分研磨勻漿，轉移至離心管中，用7 mL 磷酸緩沖液沖洗研缽，合并提取液，在4 ℃下離心（4 000 r·min-1，5 min），取上清液即為多酚氧化酶提取液。

（3）多酚氧化酶活性測定。將0.5 mL 鄰苯二酚加入2 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）中，加入0.5 mL 酶提取液，立即于410 nm 波長下測定吸光值，2 min 后記下吸光值，以不加酶提取液的反應液作為對照，空白為2.5 mL 緩沖液和0.5 mL 鄰苯二酚溶液。按公式（5）計算多酚氧化酶活性（U·g-1·min-1），以每分鐘A410變化0.01為一個多酚氧化酶活性單位（U）。

式中：A410為反應時間內吸光度的變化；W為樣品鮮重，g；t為反應時間，min；VT為提取酶液總體積，mL；VS為測定時取用酶液體積，mL。

1.2.7 數據處理

試驗均重復3 次，數據以“平均值±標準差”表示，利用Graphpad Prism 10 軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 石仙桃提取物對DPPH、ABTS 自由基的清除能力分析

由圖1 和圖2 得出，石仙桃提取液清除DPPH、ABTS 自由基的能力隨濃度增加而上升，具有較好的線性關系。單獨黃酮對DPPH、ABTS 自由基的清除能力隨濃度的增加逐漸增大，在濃度100 μg·mL-1下清除率分別達到了84.9%和87.0%；單獨多糖的清除率也隨著濃度的增加上升，但總體抗氧化活性遠低于單獨黃酮，最高濃度下清除率分別為16%和15%，均低于20%；黃酮與多糖復配后對DPPH、ABTS 自由基的清除效果較好，但低于單獨黃酮的清除率，可能的原因是多糖屬于大分子物質，在與黃酮復配后，黃酮與多糖發生相互作用，黃酮的部分抗氧化活性基團被掩蓋，使黃酮的活性基團暴露減少，掩蓋了黃酮的自由基清除能力。黃酮類化合物酚羥基的氫原子直接參與自由基的清除，可將自身氫原子供給自由基使自由基氧化活性減弱。綜上，石仙桃中的體外抗氧化活性物質主要是黃酮。

圖1 石仙桃黃酮和多糖對DPPH 自由基清除能力的影響圖

圖2 石仙桃黃酮和多糖對ABTS 自由基清除能力的影響圖

2.2 石仙桃黃酮和多糖對鮮切蘋果多酚氧化酶活性測定結果分析

由圖3 可得出，蘋果在不同濃度的石仙桃提取液浸泡后，純黃酮和純多糖提取液對多酚氧化酶活性的抑制效果隨溶液濃度的增加而更加明顯，與未做處理的空白組對比有明顯降低趨勢。多糖在抑制多酚氧化酶活性方面的表現比清除自由基好，可能原因是多糖清除自由基主要依靠表面的負電荷結合電子，但結合效果不好；多酚氧化酶是金屬蛋白酶，多糖可以與其發生金屬螯合使其失去活性。而且多糖具有成膜性，可以在蘋果切片表面形成保護膜，避免蘋果切片與氧氣接觸，減緩了蘋果切片的褐變。在復配提取液中浸泡后，多酚氧化酶活性隨溶液的濃度增加，抑制效果更明顯，但抑制效果大體上略低于單獨黃酮和多糖。可能的原因是多糖屬于大分子物質，在與黃酮復配后，黃酮與多糖發生相互作用，黃酮的部分抗氧化活性基團被掩蓋，使黃酮的活性基團暴露較少，兩者互相作用，導致抑制酶活性能力下降。石仙桃多糖和黃酮對鮮切蘋果有較好的抗褐變能力，抗褐變的可能機制：①黃酮和多糖可能會抑制酚類物質的合成進而抑制多酚氧化酶的活性，從而減緩褐變的發生；②黃酮和多糖與多酚氧化酶的活性部位結合形成復合物，阻止其與底物的結合；③黃酮和多糖可以保護蘋果細胞膜完整性，降低膜脂過氧化的程度，從而減少褐變的發生。

圖3 石仙桃黃酮-多糖提取液對蘋果多酚氧化酶活性的影響圖

3 結論

本研究以超聲波輔助雙水相提取石仙桃中的黃酮和多糖，通過實驗對石仙桃中黃酮和多糖的抗氧化作用進行評價。結果表明，石仙桃中的體外抗氧化物質以黃酮為主，濃度為100 μg·mL-1的石仙桃黃酮溶液對DPPH 和ABTS 自由基的清除率分別達到了84.9%和87.0%；石仙桃黃酮和多糖以及黃酮-多糖復合物對抑制蘋果多酚氧化酶有一定的積極作用。未來的研究中還需要進一步研究石仙桃提取物對鮮切蘋果的抗褐變機制。本研究為石仙桃的高值化利用提供了參考，并為功能性食品的開發與果蔬保鮮提供了新的理論依據。