超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀測定葡萄中的兩種甜味劑

◎ 曹 佳，陳旭晉，周鋒杰，陸宇陽

（蘇州市農產品質量安全監測中心，江蘇 蘇州 215000）

常見的甜味劑如甜蜜素（環己基氨基磺酸鈉）和紐甜，它們是一類食品添加劑，往往添加于加工后的食品和飲料中[3]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）規定，新鮮水果中不允許使用香料、香精等食品添加劑[4]。

目前甜味劑的常用檢測方法有氣相色譜法[5-6]、液相色譜法[7-9]、液質聯用法[10-12]，其中氣相色譜法和液相色譜法的前處理過程較為煩瑣，涉及目標物的轉化，步驟較多，且試劑消耗量大，目前針對固體樣品主要采取此類方法。而液質聯用法的前處理過程相對簡單，但目前的文獻資料主要用于白酒[13]、飲料[14]等液體樣品，在固體樣品中的應用較少。

本文建立一種使用三重四極桿液質聯用儀檢測葡萄樣品中甜蜜素和紐甜的檢測方法，前處理方法參考現有的國標和文獻方法中水果的液相法和酒類的液質的方法，并進行優化完善，具有操作簡單、分辨率高、抗干擾力強等特點，為檢測包括新鮮水果在內的固體樣品中的甜味劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮葡萄樣品（市售）；環己基氨基磺酸鈉標準品（1 000 mg·L-1，上海安譜）；紐甜標準品（1 000 mg·L-1，上海安譜）；甲醇（Honeywell，色譜純）；乙酸銨（Honeywell，色譜純）；實驗用超純水為一級水（超純水機Dinect Q-3 制備）。

1.2 儀器與設備

三重四極桿液質聯用儀（型號HPMS-TQ，華譜儀器）；超純水機（Dinect Q-3）；高速離心機（德國eppendorf 公司）；百分之一電子天平（ADAM PGC1502i）；超聲波清洗機（深圳潔盟）；試管振蕩器（CST）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

單標儲備液（100 mg·L-1）：分別精確吸取1 mL環己基氨基磺酸鈉標準溶液和紐甜標準溶液于各自的10 mL 容量瓶中，定容至刻度。

混標中間液a（1 mg·L-1）：分別精確吸取100 μL上述各單標儲備液于同一10 mL容量瓶中，定容至刻度。

經權之間是相輔相成的關系，是你中有我、我中有你的辯證思維。“經”是恒常不變的原則與規律，如果固守于經，便會走向極端與僵化；“權”是達經的方法與手段，如若執意行權而無視經，則會使思想行為失去理論指導。經與權都是人們在面對具體事物和情境時，做出具體的實踐活動，理解、分析、權衡、判斷都是具體體現。《孟子·離婁上》對“嫂溺，則援之以手乎？”悖論境地的處置，就是權變的最好詮釋。

混標中間液b（0.1 mg·L-1）：精確吸取1 mL 上述混標中間液a 于10 mL 容量瓶中，定容至刻度。

標準曲線：分別吸取100 μL、200 μL、500 μL 的混標中間液b 和100 μL、200 μL、500 μL 的混標中間液a 于各自的10 mL 容量瓶中，定容至刻度，得到濃度為1 μg·L-1、2 μg·L-1、5 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1的標準曲線。

1.3.2 樣品前處理

稱取勻漿后的樣品10 g（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加10 mL 超純水，振蕩2 min 后超聲提取10 min，8 000 r·min-1轉速下離心3 min，取上清液過0.22 μm 水系濾膜，收集于進樣小瓶中，待測。

1.3.3 儀器條件

（1）色譜條件。流動相A：5 mmol·L-1乙酸銨；流動相B：甲醇；流速：0.3 mL·min-1；色譜柱：waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；梯度洗脫條件如表1 所示。

表1 流動相梯度洗脫條件表

（2）質譜條件。ESI 離子源，多反應監測MRM模式，掃描方式：負離子掃描；離子源溫度400 ℃，噴霧電壓-4 500 V，氣簾氣35 psi，輔助加熱氣50 psi。其他質譜條件如表2 所示。

表2 質譜條件表

1.3.4 結果計算

樣品中被測物質含量計算公式為

式中：X為樣品中被測物的含量，mg·kg-1；c為從標準工作曲線中得到的進樣液中被測物的質量濃度，μg·mL-1；V為樣品中加入的提取液的體積，mL；m為樣品的質量，g。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的選擇

選用電噴霧離子源（ESI），甜蜜素僅在負離子模式掃描時有較高的響應值，178.0/79.9 離子對的響應值最高，適合作為定量離子對，其他離子對中響應值較高的為178.0/178.0，作為定性離子對；紐甜則在正負離子模式時均有較高的響應，考慮到流動相選擇的便捷性以及避免正負模式切換對檢測結果造成不利影響，最終也選擇負離子作為紐甜的特征離子，以377.0/199.8 作為定量離子對，377.0/257.2 作為定性離子對。去簇電壓和碰撞電壓均選用響應離子對響應值最高時候的數值。采用多反應監測模式同時掃描。

2.2 液相條件的選擇

T3 色譜柱和C18色譜柱的實驗效果接近，故選用能更好地耐受高水相的T3 柱。由于采用負離子掃描模式，避免在流動相中添加乙酸或甲酸，又考慮到堿性條件對色譜柱的損傷，最終選擇在水相中添加乙酸銨來作為改性劑和緩沖劑。實驗過程中先后驗證了2 mmol·L-1、5 mmol·L-1、10mmol·L-1乙酸銨對實驗效果的影響，最后發現乙酸銨濃度為5 mmol·L-1時有較高的響應值，故最終選用5 mmol·L-1的乙酸銨作為水相的流動相。有機相為甲醇或乙腈時對檢測結果影響不大，乙腈時的出峰時間略早，甲醇時的響應值略高，峰型相對較好，最終選擇甲醇為流動相的有機相。各參數的特征離子色譜圖如圖1 和圖2 所示。

圖1 甜蜜素特征離子對色譜圖

圖2 紐甜特征離子對色譜圖

2.3 線性關系和定量限

進樣量為5 μL，以標準物質的進樣濃度為橫坐標，儀器響應值為縱坐標，繪制相應的標準曲線。各目標物在1 ～50 ng·mL-1時呈良好的線性關系，相關系數r＞0.999，如表3 所示。以信噪比（S/N）大于10 且回收率、相對標準偏差均滿足條件來確定定量限，得到該方法的定量限為5 μg·kg-1。

表3 甜蜜素和紐甜的線性關系表

2.4 回收率與精密度

將同一無本底值的陰性葡萄樣品作為基質，分別進行5 μg·kg-1、10 μg·kg-1、50 μg·kg-1的加標后，按照1.3.2 前處理方法平行測定6 次，平均檢測結果如表4 所示。甜蜜素回收率為87.6%～93.6%，RSD為1.2%～5.8%；紐甜回收率為91.2%～96.8%，RSD為2.0%～5.3%，都能夠滿足檢測的需求。

表4 甜蜜素和紐甜的回收率和精密度情況表

2.5 樣品測定

選取多種類的葡萄樣品如夏黑、紅富士、巨峰、醉金香、陽光玫瑰等按本文方法進行檢測，共檢測40 份樣品，均未檢出甜蜜素和紐甜，未發現傳言中的非法添加情況，但進行持續的監測仍然十分必要。

3 結論

葡萄是一種常見的、較為受歡迎的水果，其安全性也備受廣大消費者的關注。本文采用三重四極桿液質聯用儀，多反應監測（MRM）模式，負離子掃描，T3 色譜柱，5 mmol·L-1乙酸銨和甲醇為流動相，梯度洗脫，對葡萄樣品中的甜蜜素和紐甜進行定性、定量分析。兩種目標物按照本文的方法前處理上機檢測都有較好的添加回收率和精密度，為檢測新鮮水果或其他固體樣品中的甜味劑提供了參考。