呋蟲胺對映體對普洱茶中黑曲霉關(guān)鍵酶活性的影響

◎ 李凱茜，杜麗娟，葉艷萍，畢亞楠，李新宇，劉宏程

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205）

普洱茶是云南省名茶。目前，隨著普洱茶在世界范圍內(nèi)銷量上升，為增加原材料茶葉產(chǎn)量，化學(xué)農(nóng)藥被廣泛用于農(nóng)業(yè)病蟲害防治，有研究指出農(nóng)藥的使用每年均可挽回35%的農(nóng)藥損失[1]。但是長期大量使用農(nóng)藥會造成農(nóng)藥殘留，不僅會導(dǎo)致人和動物慢性中毒，致畸致殘，還會導(dǎo)致環(huán)境中微生物生態(tài)平衡被破壞[2]。普洱茶的發(fā)酵過程中存在多種微生物，黑曲霉的數(shù)量始終處于優(yōu)勢地位，是普洱茶生產(chǎn)加工過程中的優(yōu)勢菌種，也是影響普洱茶風(fēng)味品質(zhì)的重要菌種[3]。黑曲霉產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物1,2,3-三甲氧苯、2-二甲氧基-4-甲基苯等是普洱茶特征香氣的主要成分之一，其產(chǎn)生的有機(jī)酸和酶等物質(zhì)也對普洱茶品質(zhì)有重要影響[4]。

新煙堿型農(nóng)藥是一類尼古丁相關(guān)的神經(jīng)活性殺蟲劑，是當(dāng)前開發(fā)利用最成功的廣譜殺蟲劑[5]。目前，市面上運(yùn)用較為廣泛的新煙堿型農(nóng)藥有吡蟲啉、呋蟲胺、啶蟲脒等[6]。呋蟲胺是第三代新煙堿型殺蟲劑，通過對昆蟲的突出神經(jīng)的阻斷作用使昆蟲死亡[7]。呋蟲胺具有手性，包含了兩個對映體S-（+）-呋蟲胺和R-（-）-呋蟲胺[8]。研究表明，呋蟲胺不同對映體對昆蟲的生物活性不同[9]。例如，S-（+）-呋蟲胺對家蠅的生物活性是R-（-）-呋蟲胺的3.0 ～3.4 倍[10]。在環(huán)境介質(zhì)中，呋蟲胺不同對映體的選擇性代謝降解具有差異性[11]。陳秀等[12]發(fā)現(xiàn)在黃瓜中，S-（+）-呋蟲胺的半衰期為8.3 ～11.7 d，R-（-）-呋蟲胺的半衰期為7.6 ～10.8 d。

土壤中的微生物體及酶促成了元素循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝，土壤中的酶大部分來自生物體，尤其是微生物體[13]。農(nóng)藥的施用可導(dǎo)致酶活性水平發(fā)生變化，農(nóng)藥自身的理化性質(zhì)、施藥次數(shù)和濃度都可能抑制或激活土壤酶活性[14]。目前，很多國家通過農(nóng)藥對土壤中微生物及酶活性的影響，對農(nóng)藥生態(tài)安全進(jìn)行評價[13]。因此，研究農(nóng)藥對環(huán)境中微生物及酶活性的影響具有重要的意義。

本文以普洱茶中優(yōu)勢菌種黑曲霉為研究對象，研究在第三代新煙堿農(nóng)藥呋蟲胺不同對映體干擾下，黑曲霉中幾種新陳代謝關(guān)鍵酶類酶活性的變化情況，以期為后續(xù)新煙堿型農(nóng)藥應(yīng)用于普洱茶的安全評價及新煙堿型農(nóng)藥的降解提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱曬青毛茶，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所；馬鈴薯葡萄糖水（Potato Dextrose Broth，PDB）培養(yǎng)基；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dxtrose Agar，PDA）培養(yǎng)基；孟加拉紅（虎紅）瓊脂；NaCl（優(yōu)級純）；呋蟲胺外消旋體（Rac-（±）-呋蟲胺）（＞99%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）；S-（+）-呋蟲胺（＞99%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）；R-（-）-呋蟲胺（＞99%，上海勤路生物技術(shù)有限公司）；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒（Solarbio公司）；漆酶活性檢測試劑盒（Solarbio 公司）；丙二?；D(zhuǎn)移酶（Mal-onyl/Acetyltransferase，MAT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海莼試生物有限公司）；糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases，GTs）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海莼試生物有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

PT1600E 勻質(zhì)機(jī)（北京亞歐德鵬科技有限公司）；BSA123S-cw 電子天平（德國Sartorius 公司）；超純水儀（美國Millipore 公司）；HMJ-150 培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HZP-15 振蕩培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；SysteeVB-55 滅菌鍋（德國Systee 公司）；Alphaclean1300 超凈工作臺（力康科技有限公司）；HHWS-150 恒濕恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HC-2518R 冷凍離高速心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；TD5A-WS 高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）；F619703-05 BP 系列精密單道可調(diào)移液器（加拿大BBI）；BCD-256KT 冰箱（青島海爾股份有限公司）；722S 分光光度計(jì)（上海菁華科教儀器公司）；1530-800824 酶標(biāo)儀（德國thermoscientificg 公司）；bx51 顯微鏡（olympus 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黑曲霉菌株篩選

將普洱曬青毛茶在無菌環(huán)境中打碎，放入無菌生理鹽水和裝有小玻璃珠的三角瓶中，在振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃搖床振蕩20 min，用無菌生理鹽水將混合液進(jìn)行10 倍、100 倍、1 000 倍稀釋。分別取1 mL 各梯度稀釋液涂布于初篩平板，28 ℃培養(yǎng)，挑取黑色或褐色呈菊花狀、邊緣呈半透明或白色的菌落進(jìn)行反復(fù)分離純化，當(dāng)生長菌落形態(tài)特征一致時，用石碳酸復(fù)紅染液染色，進(jìn)行顯微鏡鏡檢，確定其是否純化。純化后的菌株用15%（V/V）的甘油于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株鑒定委托生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3.2 黑曲霉菌株培養(yǎng)

將黑曲霉菌株分別接種至PDA 和PDB 培養(yǎng)基中，分別取1 mL 20 mg·L-1的Rac-（±）-呋蟲胺、S-（+）-呋蟲胺、R-（-）-呋蟲胺稀釋液均勻噴灑于培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)28 d。試驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，每天觀察菌落形態(tài)并記錄。

1.3.3 酶活性測定

測定不同時間噴灑了不同呋蟲胺對映體的黑曲霉在生長發(fā)育過程中的幾種新陳代謝關(guān)鍵生物酶活性。①谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶：采用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶檢測試劑盒測定。②漆酶：采用漆酶活性檢測試劑盒測定。③丙二?；D(zhuǎn)移酶：采用丙二?；D(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定。④糖基轉(zhuǎn)移酶：采用糖基轉(zhuǎn)移酶酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Excel 2016 和SPSS 26.0 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和單因素方差分析，結(jié)果以3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶酶活性分析

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-Transferase，GST）是細(xì)胞體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成之一，使機(jī)體響應(yīng)多種環(huán)境脅迫、保護(hù)機(jī)體免受有毒物質(zhì)的傷害[15]。GST 具有調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育、跨膜運(yùn)輸定位、參與還原過氧化物、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損失等功能[16]。由圖1 可知，在28 d 培養(yǎng)周期中，Rac-（±）-和S-（+）-呋蟲胺培養(yǎng)基中生長的黑曲霉GST 活性相對低，尤其在培養(yǎng)后期（16 ～28 d），表明Rac-（±）-和S-（+）-呋蟲胺相較于R-（-）-呋蟲胺對真菌中的GST 有一定的抑制作用。在10 ～16 d，R-（-）-呋蟲胺培養(yǎng)基中GST 酶活性數(shù)值增加較快，由0.059 9 U·mL-1增加到最大值0.074 1 U·mL-1，之后逐漸降低至0.061 3 U·mL-1。S-（+）-呋蟲胺中酶活性在5 ～10 d增長較快，之后有一個較小的波動，在20 d 時增長至最大值0.066 0 U·mL-1，第28 d 降低至0.059 9 U·mL-1。Rac-（±）-呋蟲胺中酶活性值與S-（+）-呋蟲胺中的變化趨勢基本一致。GST 可與外源性化學(xué)物質(zhì)結(jié)合，使親電化合物變成親水物質(zhì)，將潛在或具備毒性外源性化學(xué)物質(zhì)降解并排出體外，防止其與細(xì)胞大分子共價結(jié)合對細(xì)胞造成機(jī)械性損傷[17]。因此GST 可與農(nóng)藥結(jié)合，使有機(jī)污染物分解失活并排出體外，從而降低農(nóng)藥對微生物生長的負(fù)面影響。前期農(nóng)藥的添加對GST 有一定的刺激作用，隨著微生物對呋蟲胺不同對映體的不斷分解，GST 酶活性隨著農(nóng)藥的減少而降低。

圖1 不同培養(yǎng)基中黑曲霉的GST 酶活性圖

2.2 漆酶酶活性分析

漆酶是一種多酚氧化酶，漆酶中的銅離子在底物催化過程中可傳遞電子，漆酶還可依靠小分子介質(zhì)形成漆酶-介質(zhì)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)漆酶與底物的電子傳遞，氧化底物[18-19]。漆酶可催化的底物范圍較廣，不僅包括酚類化合物、芳香類化合物等[20]，還包括難以氧化的非酚類物質(zhì)，如多環(huán)芳香烴、有機(jī)磷農(nóng)藥、有機(jī)氯農(nóng)藥等[21]。由圖2 可知，3 種培養(yǎng)基中的漆酶活性變化趨勢相似，0 ～5 d 酶活性均快速升高，5 ～21 d 酶活性平緩升高，21 d 后酶活性明顯下降。在0 ～10 d R-（-）-呋蟲胺中生長的黑曲霉的漆酶活性值較其他培養(yǎng)基低，由1.111 U·mL-1上升至8.083 U·mL-1，在28 d 時降低到6.910 U·mL-1。這可能是培養(yǎng)初期，農(nóng)藥濃度較高，相較于呋蟲胺其他對映體，R-（-）-呋蟲胺對漆酶有明顯抑制作用，隨著菌株生長發(fā)育，培養(yǎng)基內(nèi)農(nóng)藥被分解，農(nóng)藥濃度降低，R-（-）-呋蟲胺對漆酶的抑制作用減弱。Rac-（±）-和S-（+）-呋蟲胺培養(yǎng)基中的漆酶活性值變化趨勢相似，Rac-（±）-呋蟲胺中酶活性值先由1.573 U·mL-1上升至最大值7.867 U·mL-1，之后下降至7.126 U·mL-1。S-（+）-呋蟲胺中酶活性初始值為2.499 U·mL-1，之后酶活性先上升后下降，在28 d 時降低至7.250 U·mL-1。

圖2 不同培養(yǎng)基中黑曲霉的漆酶酶活性圖

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶酶活性分析

糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyltransferases，GTs）可將單糖共價連接到多種有機(jī)底物上，參與生命體內(nèi)的糖代謝和糖基化反應(yīng)，其催化底物包括糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[22-23]?，F(xiàn)有研究表明，GTs 在真菌細(xì)胞壁的合成中起到至關(guān)重要的作用，葡聚糖是細(xì)胞壁的重要組成部分，在葡聚糖合成過程中GTs 可通過對其結(jié)構(gòu)的修飾，影響真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和功能[24]。由圖3 可知，Rac-（±）-呋蟲中的黑曲霉GTs 酶活性值大體上高于S-（+）-和R-（-）-呋蟲胺培養(yǎng)基中的GTs 酶活性值。在黑曲霉生長發(fā)育前中期，需要大量分泌GTs，參與細(xì)胞體內(nèi)新陳代謝、細(xì)胞壁合成，因此酶活性明顯上升。后期菌株生長繁殖減弱，新陳代謝減弱，酶活性逐漸降低。S-（+）-和R-（-）-呋蟲胺培養(yǎng)基中，酶活性均在5 ～12 d 大幅增長，12 ～28 d 數(shù)值浮動較小，酶活性最大值分別為649.4 U·mL-1及631.2 U·mL-1，28 d 時酶活性分別為631.2 U·mL-1和608.4 U·mL-1。Rac-（±）-呋蟲胺中GTs 酶活性值經(jīng)歷了兩個大幅上升的階段，0 ～5 d 其浮動較小，5 ～12 d 酶活性值攀升至650.9 U·mL-1，16 ～21 d 酶活性上升至最高點(diǎn)871.2 U·mL-1，28 d 時酶活性下降至748.8 U·mL-1。這可能是因?yàn)檫幌x胺不同對映體對GTs 均有抑制作用，隨著農(nóng)藥被分解，農(nóng)藥濃度下降，Rac-（±）-呋蟲胺抑制作用較另外兩個對映體明顯減弱，酶活性上升。

圖3 不同培養(yǎng)基中黑曲霉的GTs 酶活性圖

2.4 丙二?；D(zhuǎn)移酶活性分析

丙二?；D(zhuǎn)移酶（Malonyl Transferase，MAT）是細(xì)胞新陳代謝的關(guān)鍵酶類，其參與了脂肪酸的合成代謝，參與合成TAC 所需的乙酰輔酶A[25]。由圖4 可知，在28 d 培養(yǎng)周期中，R-（-）-、S-（+）-和Rac-（±）-呋蟲胺培養(yǎng)基的MAT 活性值變化趨勢一致，無明顯差異，均平穩(wěn)上升，在16 d 后趨于平穩(wěn)，維持在200 U·mL-1左右。

圖4 不同培養(yǎng)基中黑曲霉的MAT 酶活性圖

這可能因?yàn)镸AT 參與了菌株的營養(yǎng)物質(zhì)利用，黑曲霉菌株在液體培養(yǎng)基中的前中期生物量逐漸增大，能夠通過分泌更多的酶類，加快有機(jī)質(zhì)的降解，MAT 酶活性也隨之呈上升趨勢。后期隨著培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的減少，菌絲生長速度開始下降，酶活性隨之趨于平緩。MAT 酶活性在一定程度上可反映菌株活力。

3 結(jié)論

對普洱茶優(yōu)勢菌種黑曲霉進(jìn)行分離純化，分別接種于噴灑了R-（-）-呋蟲胺、S-（+）-呋蟲胺和呋蟲胺外消旋體（Rac-（±）-呋蟲胺）的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并測定不同時間不同培養(yǎng)基中黑曲霉在生長發(fā)育過程中的幾種新陳代謝關(guān)鍵生物酶活性。結(jié)果表明，呋蟲胺對映體對漆酶活性抑制作用的排序?yàn)镽-（-）-呋蟲胺＞S-（+）-呋蟲胺、Rac-（±）-呋蟲胺，對谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制作用的排序?yàn)镾-（+）-呋蟲胺、Rac-（±）-呋蟲胺＞R-（-）-呋蟲胺；對糖基轉(zhuǎn)移酶抑制作用的排序?yàn)镾-（+）-呋蟲胺、R-（-）-呋蟲胺＞Rac-（±）-呋蟲胺；對丙二酰基轉(zhuǎn)移酶的抑制作用，R-（-）-呋蟲胺、S-（+）-呋蟲胺和Rac-（±）-呋蟲胺無明顯區(qū)別。呋蟲胺不同對映體對同種酶活性影響存在差異性，下一步可進(jìn)行呋蟲胺不同對映體在不同酶條件下的降解情況及降解機(jī)制的深入研究。手性農(nóng)藥不同異構(gòu)體對普洱茶中微生物及酶的影響有重要的意義，可為普洱茶安全評價和手性農(nóng)藥殘留降解提供新的思路。