在線固相萃取-高效液相色譜法快速測(cè)定果汁中的苯并咪唑類(lèi)殘留量

◎ 何瑞雪，彭 蕓，游 靖，何 玥，曾 瑋

（1.珠海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 珠海 519000；2.安捷倫科技（中國(guó)）有限公司，廣東 廣州 510000）

多菌靈、甲基硫菌靈和噻苯達(dá)唑是常見(jiàn)的苯并咪唑類(lèi)殺菌劑，具有高效性和廣譜性，常用于果蔬的病蟲(chóng)害防治[1-3]。這些物質(zhì)在美國(guó)、加拿大、歐盟等國(guó)家和地區(qū)已被禁止在食品中使用，但我國(guó)并未禁止使用，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）給出了這3 種物質(zhì)在各類(lèi)食品中的最大殘留限量。

目前有多種方法對(duì)果蔬中多菌靈、甲基硫菌靈和噻苯達(dá)唑殘留物進(jìn)行分析，包括表面增強(qiáng)拉曼散射法[4]、熒光光譜法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等。為了降低基質(zhì)效應(yīng)，農(nóng)藥殘留物的檢測(cè)往往需要一定的前處理方法。常用的前處理方法有液液萃取[8]、傳統(tǒng)固相萃取[9]、分散固相萃取[10]、在線固相萃取[11-12]等。液液萃取溶劑消耗量大，傳統(tǒng)固相萃取樣品量需求大，而在線固相萃取樣品消耗小且可以重復(fù)使用吸附劑，可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和低成本的工作流程[13]。

本研究通過(guò)高效液相色譜儀搭載在線固相萃取裝置，建立了檢測(cè)果汁中多菌靈、甲基硫菌靈和噻苯噠唑含量的方法。本方法節(jié)省了樣品前處理時(shí)間和前處理所需的試劑與耗材，無(wú)須用到液質(zhì)聯(lián)用儀即可達(dá)到質(zhì)譜檢測(cè)的靈敏度，節(jié)省了儀器成本。此外，萃取小柱經(jīng)在線活化后可反復(fù)使用，解決了離線固相萃取處理耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

多菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，1 000 μg·mL-1，含量≥99%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，1 000 μg·mL-1， 含量≥99%，F(xiàn)irst Standard； 噻苯噠唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，1 000 μg·mL-1，含量≥99%，F(xiàn)irst Standard；乙腈、甲醇，色譜純；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260 infinity Ⅱ在線固相萃取-液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器，10 mm 流量池，熒光檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；SIGMA 3K15離心機(jī)，曦瑪離心機(jī)（揚(yáng)州）有限公司；milli-Q IQ 7000 超純水系統(tǒng)，德國(guó)默克密理博公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Poroshell HPH C18（100 mm×4.5 mm，2.7 μm）； 萃取柱：PLRP-S（4.6 mm×12.5 mm，15 ～20 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；上樣泵流動(dòng)相：水-甲醇；分析泵流動(dòng)相：水-甲醇；流速：0.5 mL·min-1；切閥時(shí)間：5.0 min 萃取柱切換到二維，6.5 min 萃取柱切換到一維；二極管陣列檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、發(fā)射波長(zhǎng)315 nm；運(yùn)行時(shí)間：20 min；后運(yùn)行時(shí)間：2 min。上樣泵梯度：0 ～2 min，20%甲醇；2 ～6 min，甲醇20% →90%；6 ～10 min， 甲醇90% →100%；10 ～16.5 min， 甲醇100%；16.5 ～16.6 min， 甲醇100% →20%。 分析泵梯度：0 ～5 min，15%甲醇；5 ～9 min，甲醇15% →50%；9 ～13 min，甲醇50%→100%；13 ～15 min，甲醇100%；15 ～18 min，甲醇100%→15%。

1.3.2 在線固相萃取-高效液相色譜分析流程

在線固相萃取過(guò)程主要包括活化、進(jìn)樣、凈化、反沖、分析5 個(gè)過(guò)程。樣品組分由進(jìn)樣器引入在線固相萃取柱上純化和富集，干擾物則從柱上流出并排至廢液中，分析柱處于清洗和平衡的狀態(tài)；切換六通閥后，分析泵流動(dòng)相將目標(biāo)化合物從在線固相萃取柱上反沖到分析柱上，此時(shí)在線固相萃取柱和分析柱形成串聯(lián)通路；待目標(biāo)化合物全部轉(zhuǎn)移后，再次切換六通閥，使在線固相萃取柱和分析柱處于分離狀態(tài)，目標(biāo)化合物在分析柱上進(jìn)行分離和定量分析，在線固相萃取柱則進(jìn)行清洗和平衡過(guò)程，等待下一次進(jìn)樣。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：準(zhǔn)確移取多菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg·mL-1）、噻苯噠唑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg·mL-1）、甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（1 000 μg·mL-1）各100 μL 到10 mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，-20 ℃冰箱避光保存，該混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為10 μg·mL-1。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10 μg·mL-1）0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL 和2.00 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，移取1 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05 mL、0.10 mL 到10 mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，-20 ℃冰箱避光保存，分別配成系列1混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為0.005 μg·mL-1、0.050 μg·mL-1、0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.500 μg·mL-1、1.000 μg·mL-1和2.000 μg·mL-1；系列2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為0.01 μg·mL-1、0.05 μg·mL-1、0.10 μg·mL-1、0.20 μg·mL-1、0.50 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1和2.00 μg·mL-1。

1.3.4 樣品前處理

果汁樣品經(jīng)過(guò)9 000 r·min-1離心5 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜后，進(jìn)高效液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 上樣泵流動(dòng)相及梯度選擇

上樣泵的主要作用是純化和富集目標(biāo)化合物，在洗脫過(guò)程中能盡快使目標(biāo)化合物洗脫至分析柱中，同時(shí)又不影響目標(biāo)化合物在分析柱上的分離。為確定上樣泵的條件，在不接分析泵和分析色譜柱的情況下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣后直接洗脫至檢測(cè)器檢測(cè)。PLRP-S 在線固相萃取小柱采用聚合物型反相吸附劑，支持逆流，適用范圍廣，通過(guò)實(shí)驗(yàn)考察了甲醇、水作為上樣流動(dòng)相時(shí)3 種化合物的保留情況。結(jié)果顯示，多菌靈、甲基硫菌靈以及噻苯噠唑均能有效保留，洗脫過(guò)程采用高比例甲醇進(jìn)行洗脫，3 種農(nóng)藥均能在1.5 min 內(nèi)有效洗脫，由此確定洗脫至分析柱過(guò)程的切閥時(shí)間，完成分析后在線固相萃取小柱進(jìn)行清洗和平衡過(guò)程，等待下一次進(jìn)樣。

2.1.2 分析泵流動(dòng)相及梯度選擇

為使多菌靈、甲基硫菌靈以及噻苯噠唑3 種物質(zhì)達(dá)到良好的分離效率，采用3 種物質(zhì)的單標(biāo)和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)分析泵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。分別采用水、體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸水溶液、離子對(duì)試劑（吸取7.00 mL磷酸于100 mL 水中，加入1.0 g 辛烷磺酸鈉，溶解，加入10.00 mL 三乙胺，加水定容至1 000 mL）、0.02 mol·L-1乙酸銨水溶液、0.02 mol·L-1乙酸銨水溶液（加入體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸）作為水相，甲醇和乙腈作為有機(jī)相，考察流動(dòng)相對(duì)色譜分離效率的影響。結(jié)果表明，離子對(duì)試劑、0.02 mol·L-1乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相，3 種物質(zhì)均不出峰；在0.02 mol·L-1乙酸銨水溶液的基礎(chǔ)上加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸，3 種物質(zhì)可出峰但色譜峰峰形寬；體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系，3 種物質(zhì)可出峰，峰形對(duì)稱(chēng)，但混標(biāo)多菌靈和甲基硫菌靈峰形重疊，調(diào)整流動(dòng)相梯度均不能使多菌靈與甲基硫菌靈有效分離；水-乙腈作為流動(dòng)相體系，3 種物質(zhì)均不出峰；水-甲醇作為流動(dòng)相體系，3 種物質(zhì)可出峰，峰形窄且對(duì)稱(chēng)，且能達(dá)到較為理想的色譜分離效果，因此選擇水和甲醇作為分析泵流動(dòng)相。

2.1.3 檢測(cè)器參數(shù)的優(yōu)化

在相同的色譜條件下，采用3 種物質(zhì)的單標(biāo)和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)檢測(cè)器參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。采用二極管陣列檢測(cè)器于200 ～800 nm 波長(zhǎng)下掃描，發(fā)現(xiàn)3 種物質(zhì)在280 nm 處吸收強(qiáng)度較大，因此選擇該波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。采用熒光檢測(cè)器固定發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行多激發(fā)波長(zhǎng)檢測(cè)，以及固定激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行多發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)的方法，得到激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、發(fā)射波長(zhǎng)315 nm 的檢測(cè)條件，但甲基硫菌靈在熒光檢測(cè)器上無(wú)響應(yīng)，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

1—多菌靈；2—噻苯噠唑；3—甲基硫菌靈。圖1 3 種化合物的色譜圖（二極管陣列檢測(cè)器）

2.2 線性范圍和檢測(cè)限

由表1和表2可知，采用二極管陣列檢測(cè)器，多菌靈、甲基硫菌靈以及噻苯噠唑在0.01 ～2.00 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限均為0.01 μg·mL-1；采用熒光檢測(cè)器，多菌靈以及噻苯噠唑在0.005 ～2.000 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限均為0.005 μg·mL-1，在熒光檢測(cè)器上可得到更高的響應(yīng)值和更低的檢出限。

表1 3 種化合物的線性關(guān)系、檢出限表（二極管陣列檢測(cè)器）

表2 2 種化合物的線性關(guān)系、檢出限表（熒光檢測(cè)器）

2.3 回收率與精密度

采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，在樣品中分別加入4 個(gè)濃度水平的待測(cè)物，每個(gè)水平重復(fù)6 次，計(jì)算加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。采用二極管陣列檢測(cè)器，在蘋(píng)果汁和梨汁基質(zhì)中，加標(biāo)回收率在89.4%～106.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.3%～4.5%；采用熒光檢測(cè)器，在蘋(píng)果汁和梨汁基質(zhì)中，加標(biāo)回收率在94.5%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.2%～5.4%，回收率和精密度均符合化學(xué)分析方法的要求。

表3 二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)蘋(píng)果汁和梨汁中3 種化合物的回收率和精密度表（n=6）

表4 熒光檢測(cè)器檢測(cè)蘋(píng)果汁和梨汁中2 種化合物的回收率和精密度表（n=6）

3 結(jié)論

本研究建立了在線固相萃取-高效液相色譜法快速測(cè)定果汁中的多菌靈、甲基硫菌靈和噻苯噠唑殘留量分析方法，樣品經(jīng)高速離心處理，直接進(jìn)高效液相色譜儀，采用以聚合物為填料的PLRP-S 萃取柱進(jìn)行凈化和富集后，切換六通閥使目標(biāo)物進(jìn)入C18分析柱分離，采用甲醇-水為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，分別用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)和熒光檢測(cè)器檢測(cè)。樣品提取步驟是整個(gè)檢測(cè)中至關(guān)重要的一環(huán)，影響著實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精密度，該方法樣品無(wú)須復(fù)雜的前處理，凈化和富集過(guò)程完全由液相色譜儀在線固相萃取系統(tǒng)自動(dòng)完成，與傳統(tǒng)前處理方法相比，不僅避免了離線固相萃取前處理過(guò)程中復(fù)雜煩瑣的步驟，減少了提取步驟中由人為因素導(dǎo)致回收率偏低和重復(fù)性差的情況，而且試劑消耗量小，降低了檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)成本，提高了檢測(cè)的效益，為果汁中多菌靈、甲基硫菌靈和噻苯噠唑殘留量的檢測(cè)提供技術(shù)支持，也可為其他藥物的快速檢測(cè)提供參考依據(jù)。