三色藜麥多糖含量測定及其抗氧化研究

◎ 于智遠，張 楠，田向陽，何春龍

（內蒙古醫科大學 藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110）

藜麥是一年生的藜科雙子葉草本作物，其籽實麩皮呈紅、白、黑三色，在20 世紀90 年代引入我國。藜麥中含有8 種人體必需氨基酸、多糖、多酚、黃酮等活性物質[1]。藜麥可以起到調節免疫應答和內分泌系統、均衡人體所需營養、修復機體損傷、強健體魄的功能。內蒙古自治區作為藜麥的主產地之一，市場占有率很高。本文通過超聲提取法測定內蒙古自治區紅、白、黑3 種不同顏色藜麥的多糖含量，并比較藜麥多糖的抗氧化性[2-8]，為內蒙古自治區藜麥的質量評價和推廣應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

藜麥（紅色、白色、黑色）為市場采購，產地為烏蘭察布。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（批號：110773-101915），合肥巴斯夫生物科技有限公司；無水葡萄糖對照品，國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水。

TU-1901 型紫外可見分光光度計，北京普析通用有限責任公司；SB25-12 DTD 超聲儀，寧波市新芝生物科技股份有限公司；分析天平（十萬分之一、萬分之一），賽多利斯科學儀器有限公司；TQL-20M 高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；HYCD-282C 醫用冷藏冷凍箱，青島海爾生物醫療股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藜麥預處理

將紅、白、黑這3 種顏色的藜麥置于烘箱中烘干至恒重，粉碎過40 目篩，密封備用。①脫脂：分別取3 種顏色藜麥粉5.0 g 于離心管中，各加入50 mL 石油醚，離心管靜置過夜，4 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，殘渣揮干石油醚。②除單糖和低聚糖：向上述殘渣中加入50 mL 95%乙醇，靜置過夜，4 000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，殘渣揮干溶劑。收集藜麥殘渣并放入減壓干燥箱中，干燥至恒重。

1.2.2 藜麥多糖提取

取處理后的藜麥殘渣加入適量蒸餾水后，在超聲功率300 W、超聲時間30 min、超聲溫度60 ℃條件下超聲提取藜麥多糖后，4 000 r·min-1離心10 min，將上清液倒入另一個離心管中，向離心管中加入4 倍體積的95%乙醇，置于4 ℃冰箱中醇沉24 h。接著4 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。沉淀依次用無水乙醇和丙酮洗滌后，低溫減壓干燥，得到藜麥多糖。

1.2.3 藜麥多糖提取試驗優化

取藜麥粉末適量，按照“1.2.1”方法處理，殘渣按照“1.2.2”方法，按照不同料液比，即藜麥殘渣∶水（g∶mL）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30），采用超聲波提取法，在超聲功率300 W，超聲溫度60 ℃，超聲30 min，提取3 次的條件下，提取藜麥多糖，計算多糖提取率。藜麥多糖提取率=藜麥多糖重量/藜麥粉末稱樣量×100%。

1.2.4 標準曲線制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成0.1 mg·mL-1葡萄糖對照品溶液。精密量取對照品溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL 和0.5 mL，分別置于6 支10 mL 具塞試管中，分別加蒸餾水2 mL、1 mL 5%苯酚溶液、5 mL 硫酸，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為0 mg·mL-1、0.001 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.003 mg·mL-1、0.004 mg·mL-1和0.005 mg·mL-1的葡萄糖對照品溶液，放置10 min 后，40 ℃水浴15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以濃度為0 mg·mL-1的試管為空白對照，分別在517 nm 波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標，葡萄糖對照品濃度（mg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 精密度、穩定性、重復性、加樣回收率試驗

（1）精密度試驗。取“1.2.4”項下葡萄糖對照品溶液（0.1 mg·mL-1）0.2 mL，置于10 mL 具塞試管中，另取1 支10 mL 具塞試管做空白對照管，分別加蒸餾水2 mL，5%苯酚溶液1 mL、硫酸5 mL，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置10 min 后，40 ℃水浴15 min，取出，迅速冷卻至室溫，以空白對照管為空白對照，在517 nm 波長下測定吸光度。重復測定6 次，記錄吸光度值，計算吸光度值的RSD，考察精密度。

（2）穩定性試驗。取黑色藜麥樣品2 g，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”確定的最佳提取條件制備黑色藜麥多糖，加蒸餾水溶解并稀釋至500 mL容量瓶刻度線，搖勻，精密量取該溶液0.1 mL 至10 mL具塞試管中，其余操作按照“1.2.5”項下“精密度試驗”方法操作，在517 nm 波長下，分別于0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min和150 min 測定吸光度，計算吸光度值的RSD，考察溶液的穩定性。

（3）重復性試驗。取黑色藜麥樣品約2 g，共6 份，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”確定的最佳提取條件分別制備黑色藜麥多糖，分別加蒸餾水溶解并稀釋至500 mL 容量瓶刻度線，搖勻，從中分別精密量取該溶液0.1 mL 至6 支10 mL 帶塞試管中，其余操作按照“1.2.5”項下“精密度試驗”方法操作，在517 nm波長下分別測定其吸光度，并代入“1.2.4”項下標準曲線，計算多糖濃度，計算每份樣品的多糖含量，并計算RSD，考察重復性。

（4）回收率試驗。取黑色藜麥樣品約1 g，共6 份，分別加入葡萄糖對照品60 mg，按照“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”確定的最佳提取條件分別制備黑色藜麥多糖，加蒸餾水溶解并稀釋至500 mL 容量刻度線，搖勻，從中分別精密量取該溶液0.1 mL 至6 支10 mL帶塞試管中，其余操作按照“1.2.5”項下“精密度試驗”方法操作，在517 nm 波長下分別測定其吸光度，并帶入“1.2.4”項下標準曲線，計算相應多糖濃度、含量、回收率、平均回收率和RSD，考察準確度。

1.2.6 藜麥多糖含量的測定

分別取3 種顏色的藜麥樣品各2 g，每種顏色各3 份，按“1.2.1”“1.2.2”方法，“2.1”確定的最佳提取條件分別制備藜麥多糖，分別加蒸餾水溶解于500 mL 容量瓶，搖勻，從中分別精密量取該溶液0.1 mL至10 mL 帶塞試管中，其余操作按照“1.2.5”項下“精密度試驗”方法操作，在517 nm 波長下分別測定吸光度，并帶入“1.2.4”項下標準曲線，計算多糖濃度。多糖含量的計算公式為

式中：C為由標準曲線計算出的多糖濃度，mg·mL-1；W為藜麥粉末稱樣量，g。

1.2.7 藜麥多糖體外抗氧化活性測定

（1）溶液的制備。①DPPH 供試液的配制。精密稱取50 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容到100 mL棕色量瓶中，搖勻。精密量取10 mL DPPH 溶液至另一100 mL 棕色量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.05 mg·mL-1的DPPH 供試液（a）。②藜麥多糖溶液的配制。分別取0.05 g、0.10 g、0.20 g、0.25 g 和0.30 g 的三色藜麥多糖置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水溶解并稀釋至刻度，配制成濃度分別為0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1和0.30 mg·mL-1的多糖供試液（b）。

（2）DPPH 自由基清除試驗。分別取1 mL 不同濃度的多糖供試液（b）至10 mL 棕色容量瓶中，再加入4 mL 的DPPH 供試液（a），蒸餾水定容并搖勻，在室溫下靜置約30 min，在517 nm 處測定吸光度A1，同時測定1 mL 蒸餾水與4 mL DPPH 供試液（a）混勻靜置30 min 后的吸光度A2，按照DPPH 自由基清除率=[(A2-A1)/A2]×100%計算不同濃度下三色藜麥多糖對DPPH 自由基的清除率。

2 結果與分析

2.1 藜麥多糖提取試驗優化

由圖1 可知，藜麥多糖的提取率隨著提取液用量的增加逐漸增大，當料液比為1 ∶25 時，藜麥多糖的提取率最高，為5.37%，而繼續增加提取液用量時，提取率開始下降，故確定最佳料液比為1 ∶25。因此，藜麥多糖最佳提取條件為超聲功率300 W、提取溫度60 ℃、提取時間30 min、料液比1 ∶25、提取次數3 次。

圖1 不同料液比對藜麥多糖提取率的影響圖

2.2 標準曲線

由圖2 可知，葡萄糖對照品的線性回歸方程為y=107.4x-0.053，R2=0.999 1。

圖2 葡萄糖對照品標準曲線圖

2.3 精密度、穩定性、重復性和回收率試驗

2.3.1 精密度試驗

由表1 可知，葡萄糖對照品溶液的RSD為1.15%，不超過2.0%，表明儀器精密度良好。

表1 精密度試驗結果表

2.3.2 穩定性試驗

由表2 可知，黑色藜麥制備的多糖溶液在不同時間下的RSD為1.96%，不超過2.0%，表明藜麥多糖溶液在150 min 內的穩定性較好。

表2 穩定性試驗結果表

2.3.3 重復性試驗

由表3 可知，黑色藜麥平行測定6 份的RSD為1.42%，不超過2.0%，表明該方法重復性良好。

表3 重復性實驗結果表

2.3.4 加標回收率試驗

由表4 可知，黑色藜麥的平均回收率為99.48%，RSD為0.40%，表明方法的準確度良好。

表4 加標回收率試驗結果表

2.4 藜麥多糖含量測定

由表5 可知，黑色藜麥多糖的平均含量為6.007%，白色藜麥多糖的平均含量為6.874%，紅色藜麥多糖的平均含量為5.965%。

表5 藜麥多糖含量測定表

2.5 抗氧化活性測定

由表6 可知，3 種顏色藜麥多糖的DPPH 自由基清除率均隨著藜麥多糖濃度的增加而增高，其中白色藜麥多糖在同一濃度下的抗氧化活性最高，黑色藜麥多糖抗氧化活性最低，當白色藜麥多糖濃度為0.30 mg·mL-1時，清除率達到了85.73%。

表6 藜麥多糖抗氧化活性測定結果表

3 結論

綜上可知，不同顏色的藜麥多糖含量以及抗氧化活性能力不同。其中，白色藜麥多糖含量最高，紅色藜麥最低。白色藜麥多糖抗氧化活性最高，黑色藜麥最低。藜麥雖然是一種食品，但在營養保健、醫藥領域方面表現出很大的優勢，被人們越來越重視。本文通過對藜麥多糖含量的測定和抗氧化作用的研究，可為藜麥的進一步深加工提供參考。