PRiME HLB 前處理技術聯合超高效液相色譜-三重四極桿質譜系統檢測水產品中17 種磺胺類藥物殘留

◎ 余海芬，徐 樺，吳真善，包 蔚，朱曉蕓，何 鍇，黃 忠，戰 濤

（上海市嘉定區農業技術推廣服務中心，上海 201800）

我國是水產養殖大國，2000 年以來，我國水產品總產量和人均占有量已超世界平均水平，是世界上唯一養殖水產品總量超過捕撈總量的主要漁業國家，并在2002 年成為世界第一大水產品出口國[1]。在水產養殖業中，抗生素主要用來預防和治療疾病，促進生長和提高飼料報酬率。磺胺類藥物是一類人工合成抗生素，在畜牧水產養殖業中被廣泛使用，但其在動物性食品中的殘留問題一直備受關注。磺胺類藥物可通過食物鏈進入人體，引起過敏反應、皮疹、惡心和嘔吐等，在人體內長時間蓄積還可能對生殖系統、神經系統、免疫系統產生潛在的毒性影響[2]。2020 年4 月1 日開始實施的《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中對磺胺類藥物在食品動物中的殘留限量進行了規定，其在水產品中的最高殘留限量為100 μg·kg-1[3]。目前，檢測水產品中磺胺類藥物殘留的國家標準方法有酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法[4-7]。其中酶聯免疫吸附法易產生假陽性；高效液相色譜法靈敏度低、抗干擾性差，不適合多殘留檢測分析，因此普遍使用液相色譜-串聯質譜法測定水產品中磺胺類藥物。PRiME HLB通過型固相萃取柱無須活化平衡，可直接上樣，操作簡單，且對脂肪、磷脂等物質具有特異性吸附能力。而水產品樣品通常含有較多脂肪、磷脂，使用PRiME HLB 小柱可以很好地從水產樣品提取物中高效去除脂肪和磷脂，以此降低基質效應，同時不影響回收率。

本文采用PRiME HLB 前處理技術，聯合超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜系統建立了水產品中17 種磺胺類藥物簡單快速的篩選分析方法，以期為水產品中磺胺類抗生素的快速篩查提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

SCIEX ExionLC ?系統和SCIEX 6500 三重四極桿質譜系統（美國SCIEX 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Merck 公司）；固相萃取裝置（美國Supelco 公司）；M64 氮吹儀（北京Labtech 有限公司）；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（200 mg/6 mL），美國Waters 公司；C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國Waters公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈，色譜純，CNW 公司；甲酸，色譜純，MACKLIN 公司。

1.3 標準物質

磺胺脒、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲噁唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺地索辛、磺胺多辛和氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3，上海安譜實驗科技有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液配制

將17 種磺胺類藥物標準物質用甲醇溶解并定容至20 mL 容量瓶，配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標準工作液。將氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3 內標物用甲醇溶解并定容至20 mL 容量瓶，配制成1 μg·mL-1同位素內標工作液，于4 ℃下避光保存。

分別吸取適量1 μg·mL-1的磺胺混合標準工作液，用初始流動相進行稀釋，配制成濃度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1的校正曲線工作液，其中氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶-D3 濃度為5 ng·mL-1。

1.4.2 儀器條件

（1） 色譜條件。 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30 ℃；流動相為甲酸水溶液（0.1% 甲酸）和甲醇溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫：0 ～0.5 min，5%B；0.50 ～1.75 min，5%B →10%B；1.75 ～6.50 min，10%B →45%B；6.50 ～8.50 min，45%B →70%B；8.50 ～9.00 min，70%B；9.10 ～11.00 min，5%B。

（2）質譜條件。離子源：ESI 源，正離子模式；IS 電壓：5 500 V；氣簾氣：35 psi；霧化器：55 psi；輔助霧化器：55 psi；源溫度：550 ℃；碰撞氣：7 psi。

1.4.3 樣品前處理

魚類樣品去頭、骨、內臟，取肌肉、魚皮等可食用部分絞碎混合均勻備用，蝦類樣品去蝦頭、蝦皮、腸腺后絞碎混合均勻備用。準確稱取2.50 g（精確至0.01 g）組織勻漿樣品于50 mL 離心管中，加入1 μg·mL-1內標工作液25 μL，向離心管中加入10 mL 80%乙腈水溶液（含0.2%甲酸），漩渦混勻，超聲10 min。4 ℃條件下12 000 r·min-1離心5 min。取3 mL 上清液通過Oasis PRiME HLB 小柱并收集濾液，準確移取2 mL 濾液至離心管中，40 ℃氮吹至近干。用1 mL 初始流動相定容，超聲溶解2 min，過0.22 μm 有機濾膜，供超高液相色譜-三重四極桿質譜儀檢測分析。

2 結果與分析

2.1 線性范圍及檢出限、定量限

本方法采用內標法定量，將17 種磺胺類藥物的混合標準工作液配制成1.0 ～50.0 ng·mL-1濃度不等的校正曲線工作液，其中同位素內標物濃度為5.0 ng·mL-1，微孔濾膜過濾后，采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀測定，以特征離子峰面積為縱坐標，以磺胺類藥物濃度比為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，17 種磺胺類藥物的線性范圍在1.0 ～50.0 ng·mL-1，相關系數（R2）大于0.99，線性方程見表1。以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）確定方法檢出限為2 μg·kg-1，定量限為6.3 μg·kg-1。

表1 17 種磺胺類藥物的線性方程表

2.2 回收率與精密度

分別考察蝦肉和魚肉2 種基質的加標回收率和精密度。稱取2.50 g 空白樣品，加入25 μL 1 μg·mL-1混合標準工作液及25 μL 1 μg·mL-1內標工作液，待樣品充分混勻后，按照前處理步驟進行操作，用凈化后的提取液上機測定，每種樣品平行測定6 次，計算方法的回收率和相對標準偏差。從表2 可以看出，17 種磺胺藥物的平均回收率在71.3%～118.4%，相對標準偏差在1.2%～13.6%。

表2 17 種磺胺類藥物的添加回收率及相對標準偏差表（n=6）

2.3 實際樣品分析

采用本方法檢測了上海市北部地區主要河道內52 份水產品樣品，分別為青蝦、克氏原螯蝦、鳊魚、青魚、翹嘴紅鲌等。結果顯示，1 份鳊魚樣品檢出磺胺對甲氧嘧啶（24.4 μg·kg-1），1 份青魚樣品檢出磺胺二甲基嘧啶（9.7 μg·kg-1）。采用農業部1077 號公告—1—2008 方法再次對樣品進行驗證分析，發現本方法檢測結果與標準方法檢測結果具有較好的一致性。陽性樣品檢測結果見表3。

表3 陽性樣品檢測結果比較表 單位：μg·kg-1

3 結論

本文采用PRiME HLB 小柱對樣品進行凈化，同位素內標法定量，利用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀測定了水產品中17 種磺胺類化合物的含量。實驗結果表明，PRiME HLB 小柱能夠有效去除提取液中的脂肪和磷脂，同時操作簡便。該方法重復性和準確性良好，適用于水產品中磺胺類藥物的殘留檢測。