基于網絡藥理學研究活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的作用機制

鄭維宣 范鳴翔 伍英杰 劉振洋 羅建松 許和貴

骨折是指骨的完整性或連續性遭受破壞，腰椎骨折是脊柱外傷中最常見的一種骨折類型[1]。本病多發于成年人及存在骨質疏松癥的老年人，尤其以絕經后的女性為高發病人群。隨著城市化的快速發展，在我國腰椎骨折的發病率逐漸上升，不僅影響患者的生命質量，還帶來了沉重的經濟負擔[2]。腰椎骨折主要以閉合性腰椎骨折為主，主要臨床表現為腰背局部疼痛、壓痛、叩擊痛，腰部活動受限，嚴重者可能會出現大小便失禁及下肢截癱[3]，若不及時處理容易導致休克。對于閉合性腰椎骨折患者主要采用手術治療[4]，解除脊髓或神經壓迫，糾正畸形并恢復脊椎穩定性，須及早進行治療避免造成進一步的損傷?；颊咝g后容易出現術區傷口疼痛、腫脹，老年患者傷口愈合緩慢。腰椎骨折術后患者配合中藥活血接骨膠囊內服能有效改善血液循環，減輕腰背部疼痛，促進骨折加速愈合，改善脊柱活動度，提高患者日常活動能力。活血接骨膠囊是由貴州中醫藥大學第一附屬醫院骨傷科時光達教授根據臨床經驗研制后經本院改良而成[5]。活血接骨膠囊主要由蘇木、透骨草、土鱉蟲、自然銅、川芎、丹參、骨碎補、熟地黃等中藥組成，具有續筋接骨、消腫止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打損傷、筋傷骨折、瘀腫疼痛等[6]?，F代藥理學研究表明，活血接骨膠囊能夠減輕炎癥反應，增強成骨細胞和破骨細胞的活性，促進傷口愈合[7]。然而，活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的網絡藥理學研究目前尚未見相關報道。基于此，本研究基于網絡藥理學就活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的作用機制進行分析?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1 獲取活血接骨膠囊的活性成分及靶點

于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分別輸入“蘇木”“透骨草”“土鱉”“自然銅”“川芎”“丹參”“骨碎補”“熟地黃”，限定OB≥30%、DL≥0.18，再結合NCBI數據庫（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、CNKI 數據庫（https://www.cnki.net/）、BATMAN 數據庫檢索并篩選出8 味中藥的活性成分及靶點。限定物種為“Homo sapiens”，采用Uniprot 數據庫（http://beta.uniprot.org/）篩選出活血接骨膠囊活性成分對應的靶點，轉換成與之相對應的基因名稱，刪減重復項并整合，最終獲得活血接骨膠囊的活性成分及其靶點數據集。

1.2 獲取疾病的靶點

以“Closed lumbar fracture”為關鍵詞在Genecards 數據庫（http://www.genecards.org/）和OMIM 數據庫（https://omim.org/）中檢索閉合性腰椎骨折的靶點，將上述獲得的閉合性腰椎骨折的靶點進行整合，刪除重復項后即獲得閉合性腰椎骨折疾病的靶點集。

1.3 構建“藥物-成分-靶點”網絡

將篩選出的活血接骨膠囊活性成分的作用靶點與閉合性腰椎骨折疾病靶點導入在線網站venny 2.1，繪制韋恩圖并篩選出交集靶點。采用cytoscape 3.8.2軟件將中藥及其活性成分和與之對應的靶點構建“藥物-成分-靶點”網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建

將“1.3”項下篩選出的交集靶點導入String 數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，置信度≥0.9，隱藏沒有相互連接的邊，導出.tsv 文件，采用cytoscape 3.8.2 軟件對.tsv 文件進行可視化分析，繪制PPI 網絡圖。

1.5 核心靶點的篩選

將String 數據庫中的.tsv 文件導入cytoscape 3.8.2 軟件，計算拓撲參數，選擇degree 值大于4 倍中位數，介度中心性（BC）和接近中心性（CC）均大于其相應中位數的節點作為核心靶點。

1.6 基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路分析

將“1.5”項下篩選出的核心靶點，導入DAVID數據庫對其進行GO 富集分析和KEGG 信號通路分析，可以獲得活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的GO 生物學過程和關鍵信號通路。

2 結果

2.1 活血接骨膠囊的活性成分及靶點

通過數據庫結合文獻檢索共篩選出活性接骨膠囊117 個活性成分，其中蘇木有21 個，透骨草有13個，土鱉有1 個，自然銅有1 個，川芎有6 個，丹參有58 個，骨碎補有15 個，熟地黃有2 個；通過Uniprot 數據庫，共篩選出654 個藥物靶點。

2.2 疾病的靶點

采用Genecards 數據庫和OMIM 數據庫共得到閉合性腰椎骨折疾病靶點2 662 個，與活血接骨膠囊的共同靶點有264 個（圖1）。

圖1 活血接骨膠囊與閉合性腰椎骨折靶點的交集

2.3 PPI 網絡

將“1.3”項下的活血接骨膠囊與閉合性腰椎骨折的交集靶點導入String 數據庫，將其結果的.tsv 文件導入Cytoscape 3.8.2 軟件得出節數點為247、邊數為8 734，根據Degree 值大小繪制其PPI 網絡。見圖2。

圖2 PPI 網絡

2.4 “藥物-成分-靶點”網絡

將活血接骨膠囊中的各味中藥、活性成分、靶點導入cytoscape 3.8.2 軟件構建“藥物-成分-靶點”網絡（圖3），結果顯示：該網絡共有788 個節點、1 987 條邊。網絡圖中顯示，同一活性成分可作用于不同靶點，而不同活性成分也可共同作用于同一靶點，體現了活血接骨膠囊治療疾病時具有多成分多靶點協同作用的特點。

圖3 “藥物-成分-靶點”網絡

2.5 核心靶點

運用Cytoscape 3.8.2 軟件對交集靶點進行拓撲分析，并選取Degree＞40 的候選核心靶點29 個，最后采用BC＞9.65，CC＞0.69 篩選出STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 10 個核心靶點。見圖4。

圖4 核心靶點篩選流程

2.6 GO 富集分析

活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的GO 生物過程分析結果顯示，涉及共132 條GO 生物過程，包括生物學過程（BP）79 條，細胞組成（CC）16 條，分子功能（MF）37 條，繪制各類別前10 條目的柱狀圖見圖5。結果顯示，主要涉及了藥物反應、蛋白結合、基因的正表達、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調控、酶的結合、細胞因子活性等生物學過程，體現了活血接骨膠囊可通過調控多個復雜的生物過程來治療閉合性腰椎骨折。

圖5 GO 富集分析柱狀圖

2.7 KEGG 信號通路分析

KEGG 信號通路分析結果顯示：活血接骨膠囊治療閉合性腰椎骨折的信號通路有96 條，按照-lgP值排序，選取前30 條通路繪制靶點通路分類圖見圖6，結果顯示主要包括TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等信號通路。

圖6 KEGG 信號通路

同一靶點可調控不同的信號通路如：STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等靶點可參與調控TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17細胞等，提示活血接骨膠囊通過作用于多條通路來治療閉合性腰椎骨折。見圖7。

圖7 信號通路桑葚圖和氣泡圖

3 討論

活血接骨膠囊主要含有蘇木、透骨草、土鱉蟲、自然銅、川芎、丹參、骨碎補、熟地黃等中藥材，諸藥合理配伍，具有續筋接骨、消腫止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打損傷、筋傷骨折、瘀腫疼痛等疾病[5-6]。臨床研究發現蘇木、透骨草、骨碎補具有明顯的抗炎止痛作用，能降低炎癥因子水平從而緩解術后疼痛及腫脹；土鱉蟲、自然銅兩味中藥具有良好的續筋接骨作用，配合使用能促進骨折早期愈合；丹參、川芎活血化瘀，具有改善機體血液微循環作用，祛瘀生新加速骨折部位氣血運行，從而縮短骨折愈合時間；熟地黃滋陰補血，益精填髓，可營養骨骼，使骨變得更堅硬牢固[7]。

腰椎骨折屬于中醫“骨折病”范疇，主要臨床表現為傷處刺痛腫脹、腰椎活動受限。骨折后常采用內固定手術進行治療，目的是通過重建脊柱穩定性，恢復脊柱功能，改善骨折后臨床癥狀[8]。腰椎骨折使用內固定手術治療的過程易耗傷人體氣血，術后易導致氣血升降失調，運行不暢；氣血相互相乘，氣行則血行，氣滯則血瘀；氣不攝血，則血溢脈外形成瘀血，瘀血停留在局部，不通則痛，可見患者術后傷口處疼痛腫脹。高齡患者本身肝腎虧虛，氣血津液生成匱乏，術后更容易導致氣血津液不足[9-10]，可見骨折愈合緩慢，如果給予中藥活血接骨膠囊治療能夠有效緩解術后癥狀。

通過對活血接骨膠囊中的有效成分進行分析發現，部分化合物如山柰酚、槲皮素、隱丹參酮、木犀草素、芹菜素及雙氫黃酮苷等已被證實具有抗炎鎮痛和促進成骨細胞增殖作用。趙峰等[11]通過實驗研究發現山柰酚可上調miR340-5p 抑制AKT3 表達，從而阻斷AKT3/mTOR 信號通路，抑制星形膠質細胞的炎癥，增強自噬，減輕脊神經結扎大鼠的神經性疼痛。山柰酚可通過調控Wnt/β-catenin 經典途徑調節骨的發育和礦化[12]；山柰酚具有促進成骨細胞MG-63 增殖和礦化的作用[13]。槲皮素可通過上調SATB2 基因的表達促進BMSCs 增殖和成骨分化[14]；槲皮素通過抑制DANCR 的表達促進BMSCs 的增殖和成骨分化[15]；有研究發現槲皮素還可通過活性氧抑制MAPK 途徑的激活，影響心肌成纖維細胞增殖來抑制心臟纖維化[16]。木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒等功效，能有效抑制巨噬細胞磷酸化，降低轉錄因子NF-kB 的活性，減少脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞分泌細胞因子IL-6、TNF-a。其可通過調控TLR4/NF-κB 途徑減少炎癥反應的發生，從而治療某些疾病[16]。芹菜素可以促進MC3T3-E1 細胞成骨分化和礦化[17]；芹菜素能促進干細胞成骨分化[18]；芹菜素作為活血補腎方治療骨關節炎的藥效物質基礎，能降低骨關節炎的炎癥反應從而達到治療骨關節炎的作用等[19]。雙氫黃酮苷可促進骨骼對鈣離子的吸收，改善血液循環、新陳代謝，從而促進骨折早期愈合[10]。

通過對活血接骨膠囊PPI 網絡和富集分析，核心靶點為STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等，主要通過干預TNF信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等相關信號通路治療閉合性腰椎骨折。槲皮素通過調控ERK1/2-MAPK 信號通路，下調MAPK mRNA 和蛋白的表達，從而對骨質疏松有明顯預防作用[20]；槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物作為淫羊藿中的活性化合物，作用于多靶點如JUN、IL6、TNF、TP53 調控多條信號通路治療骨質疏松[21]；芹菜素在治療骨折方面的機制可能與調節OPG/RANKL/RANK 信號通路有關。研究發現使用芹菜素處理創傷性骨折大鼠模型，可以減輕大鼠炎癥反應并促進骨折愈合[22]。雙氫黃酮苷可通過調控多通路促進骨折愈合[10]。

綜上所述，活血接骨膠囊中的藥物在治療骨折、筋傷等疾病時，每一味藥物均發揮著巨大作用，具有顯著臨床療效。網絡藥理學研究發現活血接骨膠囊主要通過TNF 信號通路、TOLL 樣受體信號通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信號通路、IL-17 通路、癌癥通路、乙肝通路、Th17 細胞等途徑治療閉合性腰椎骨折。但本研究只是在分子機制方面進行了探討預測，具體藥物作用機制仍需進一步相關實驗進行驗證。