冠心舒通膠囊中的藥效成分采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測的可行性

范 洋

冠心舒通膠囊被2020 年版《中華人民共和國藥典》一部收錄，是以蒙醫藥理論為指導，由天竺黃、丹參、丁香、廣棗以及冰片5 味中藥材配伍并經現代工藝加工研制而成的中藥復方制劑品種[1]。冠心舒通膠囊在臨床上主用于治療胸痹心血瘀阻證等病證，具有通經活絡、活血祛瘀、行氣止痛之功效，適用于胸痛、氣短、胸悶、心慌等臨床癥狀，療效確切，效果顯著[2-3]。藥效成分在患者體內的分布特征以及含量變化與藥物的藥理效應密切相關[4]。有研究表示，冠心舒通膠囊中含有能夠調節免疫力，保護血管、心肌，調節血脂等重要作用的成分，如丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等脂溶性的二萜醌類化合物，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A 等水溶性的酚酸類化合物以及熊果酸等三萜類化合物，這是其發揮臨床療效的物質基礎[5]。藥代動力學反映藥物在患者體內吸收、代謝、分布以及排泄規律，對于藥物的臨床應用指導，以及療效發揮具有重要作用[6]。因此闡明冠心舒通膠囊中的主要藥效成分，對相關成分進行定量研究，不但有助于提高其藥物穩定性以及質量標準，還能夠對疾病模型體內的藥代動力學特征進行研究。目前，在分析復雜的中藥成分及其體內代謝物研究中超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry, UPLC-MSMS）法具有獨特優勢，是進行藥代動力學分析的有力手段[7]。但目前臨床上關于UPLC-MSMS 法檢測分析冠心舒通膠囊中丹參素、咖啡酸、原兒茶醛、原兒茶酸、迷迭香酸、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等藥效成分的臨床研究仍然罕見。基于此，本研究就采用UPLC-MSMS 法檢測分析冠心舒通膠囊中丹參素、咖啡酸、原兒茶醛、原兒茶酸、迷迭香酸、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等藥效成分的可行性進行分析。現報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Xevo TQD 三重四極桿質譜儀（美國Waters 公司）；Thermo Vanquish 超高效液相色譜儀、ST8R 型高速冷凍離心機、Thermo Hypersi1 GOLD C18色譜柱（2.1 mm×50 mm×1.8 μm）（美國Thermo 公司產品）；XS205DU 十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo上海儀器有限公司）；HHS 數顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市醫療儀器廠）；SYU-80-2000DT 超聲波清洗機（鄭州生元儀器有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；MTN-2800D 氮吹儀（Autoscience 儀器公司）。

1.2 樣品與試劑

對照品咖啡酸（110885-201703）、丹參素（110855-201915）、原兒茶醛（110810-202210）、原兒茶酸（110809-202207）、迷迭香酸（111871-202007）、丹參酮Ⅰ（110867-201607）、丹參酮ⅡA（110766-202323）、隱丹參酮（110852-201807）、丹酚酸A（111573-202106）、熊果酸（110742-201823）、丹酚酸B（111562-202318）（中國食品藥品檢定研究院，含量質量分數均＞97%）。水為超純水，甲醇、甲酸、乙腈均為色譜純（美國Fisher 公司），其他試劑均為分析純。冠心舒通膠囊共6 個批次（批號：220503、230211、230406、220611、230703、210601，依次將編號設為A1、A2、A3、A4、A5、A6，陜西步長制藥有限公司，國藥準字Z20020055）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

Acquity UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脫；洗脫程序：0～2 min、2～3 min、3～7 min依次為25%～60%A、5%～25%A、60%～90%A；進樣量：5 μl；流速：0.2 ml/min；柱溫：40 ℃。電噴霧離子源（ESI），噴霧電壓為3.5 kV，離子源溫度為150 ℃，采用選擇離子掃描（SIR）和多反應檢測掃描（MRM）模式，脫溶劑氣（流速為650 L/h，溫度為350 ℃），輔助氣為氮氣，碰撞氣（氬氣）壓力為2.85 Pa，錐孔氣流速為50 L/h。其他參數見表1。

表1 質譜參數

2.2 溶液制備

2.2.1 供試溶液 精密稱定冠心舒通膠囊內容物1.00 g，置于錐形瓶中，精密加入甲醇溶液20 ml（體積分數50%），密封后稱定質量，超聲處理0.5 h，冷卻后稱定質量，甲醇溶液（體積分數50%）補足減失的質量后濾過，再經0.22 μm 微孔濾膜過濾。

2.2.2 對照溶液制備 取11 種藥品成分的對照品精密稱定，與體積分數50%甲醇溶液分別配制成質量濃度約為0.5 g/L 的單一對照儲備液。精密量取單一對照儲備液適量，分別加入體積分數50%甲醇溶液配制成質量濃度為100.0 mg/L 的丹參素、質量濃度為10.0 mg/L 的咖啡酸、質量濃度為90.0 mg/L的迷迭香酸、質量濃度為30.0 mg/L 的原兒茶醛、質量濃度為450.0 mg/L 的原兒茶酸、質量濃度為100.0 mg/L 的丹酚酸A、質量濃度為1.0 g/L 的丹酚酸B、質量濃度為250.0 mg/L 的隱丹參酮、質量濃度為0.1 g/L 的丹參酮Ⅰ、質量濃度為90.0 mg/L 的丹參酮ⅡA、質量濃度為30.0 mg/L 的熊果酸的混合對照儲備液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性和范圍 精密量取混合對照儲備液，甲醇溶液（體積分數50%）稀釋并定容，配制成6 個質量濃度的系列標準溶液，見表2。進行色譜質譜分析，以峰面積為縱坐標，以各成分質量濃度（mg/L）為橫坐標，進行線性回歸，標準曲線方程及相關系數采用Masslynx 4.1 系統軟件進行關系數計算。以信噪比S/N=10 計算定量限（LOQ），信噪比S/N=3 計算檢測限（LOD），結果見表3。

表2 不同成分不同質量濃度標準溶液(g/L)

表3 各成分化合物的回歸方程、線性范圍、相關系數、LOD 以及LOQ 結果

2.3.2 穩定性、精密度以及重復試驗 取同一混合對照溶液以及實驗溶液（A1），分別于0、4、8、12、16、24 h 進樣分析，計算相應相對標準偏差（RSD）。取中質量濃度的混合對照溶液，連續進樣6 次及連續進樣3 d（每天重復進樣6 次），計算相應RSD。取A5 批次的冠心舒通膠囊內容物6 份，按“2.2.1”中方法制備供試溶液，并進行含量測定。所有RSD均≤3%，提示儀器精密度較高，24 h 內穩定性較高，重復性良好。見表4。

表4 各化合物的穩定性、精密度及重復性考察結果(RSD,%)

2.3.3 加樣回收率試驗 取9 份A6 次冠心舒通膠囊樣品，每份1.0 g，精密稱定后加入冠心舒通膠囊相應成分量的80%、100%和120%，配制低、中、高3 種質量濃度的對照混合溶液。按“2.2.1”平行制備供試溶液，并測定含量。結果顯示各成分平均回收率在98%～100%，RSD 均小于3%，提示該方法檢測所有成分的準確度較高。見表5。

表5 加樣回收率

2.4 樣品含量測定與質量評價

取不同批次冠心舒通膠囊樣本6 份，按“2.2.1”的方法平行制備供試溶液，“2.1”色譜質譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，計算冠心舒通膠囊中各成分的含量，結果顯示不同批次之間各成分含量RSD均小于9%。采用SIMCA 14.0 多元數據處理軟件進行數據分析，分析不同批次之間冠心舒通膠囊的質量穩定性。結果顯示不同藥物批次的質量偏差均控制在標準偏差左右，表明批次之間差異較小，但A5批次的質量偏差略大于2 std，與其他批次稍有差異。見表6。通過載荷分析可知原兒茶酸是導致A5 批次質量差異的主要因素，提示在以后的生產及質控中需進行重點控制。

表6 不同批次冠心舒通膠囊中各成分的含量

3 討論

冠心舒通膠囊是在5 味天然植物藥材配伍基礎上經由現代工藝加工制成的中藥復方制劑，臨床廣泛用于冠狀動脈粥樣硬化性心臟病心絞痛等疾病的治療，與西醫常規治療此類疾病的藥物如抗血栓藥物、β 受體阻滯藥、抗血小板藥物、有機硝酸鹽等藥物比較，能夠避免血壓和心率降低、血栓以及血流動力學變化等[8-9]。但目前臨床上對于冠心舒通膠囊中含有的有關成分的臨床研究仍然罕見，且不夠清晰。黃小婧等[10]的研究表示，通過UPLC-MSMS 法檢測冠心蘇合制劑10 種非法添加色素的質量評價參考價值較高。為此作者采用UPLC-MSMS 法檢測分析冠心舒通膠囊中相關藥效成分。

實驗中作者進行了色譜優化：通過設置不同比例與類型的流動相，分析對比不同流動相中各個成分的分離效果，選擇最優流動相進行分析。結果表明，在流動相梯度洗脫時采用乙腈-體積分數0.1%甲酸水，分離效果最佳，色譜峰形好，利于冠心舒通膠囊中不同成分的檢測分析。為使所有成分均具有良好的溶解性，實驗考察了不同濃度甲醇、不同超聲時間及溶劑效應對提取成分的影響。結果顯示，超聲提取30 min，甲醇溶液體積分數為50%作為提取條件時，各成分的響應較優，無重復析出現象。選擇UPLC-MSMS 進行多組分含量同時測定，在優化過程中研究采用了正負離子結合多模式檢測，最終丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮采用正離子模式，其他成分采用負離子模式，除熊果酸以外的其他成分采用MRM 檢測，熊果酸采用SIR 檢測。同時測定結果顯示，不同批次的冠心舒通膠囊中的活性成分含量差異較小，RSD 均在10%以內。含量測定分析表明不同批次的冠心舒通膠囊總體質量較為穩定，偏差＜2 std，但亦存在批次之間的微小差異，應對原兒茶酸含量進行更加精細的控制，與左莉華等[11]的研究相似。

綜上所述，采用UPLC-MSMS 法檢測分析冠心舒通膠囊中，丹參素、咖啡酸、原兒茶醛、原兒茶酸、迷迭香酸、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹酚酸A、丹酚酸B 和熊果酸等藥效成分在不同批次中質量穩定，且檢測穩定性、精密度均較高，能夠從整體上綜合評價藥物質量，利于此藥品的質量控制。