氣相色譜-質譜聯用法用于測定鹽酸普羅帕酮原料藥中基因毒性雜質環氧氯丙烷的可行性

付金鳳 蔣曉勤

鹽酸普羅帕酮為廣譜抗心律失常藥物，通過降低動作電位升高速率而減慢沖動傳導，可延長心房和房室結及心室的不應期，用于治療室性心律失常、心動過速以及心房纖顫等[1-2]。鹽酸普羅帕酮的合成工藝眾多，但大多以環氧氯丙烷作為主要原料[3]。環氧氯丙烷的環氧結構為警示結構，是潛在基因毒性雜質[4-6]。2017 年10 月27 日，世界衛生組織國際癌癥研究機構公布的致癌物清單中將環氧氯丙烷分類為2A 類致癌物。因此，對鹽酸普羅帕酮中環氧氯丙烷殘留量進行控制顯得尤為重要。目前，常用的環氧氯丙烷檢測方式有離子色譜法（IC）、氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）[7-10]。其中，GC-MS 因其靈敏度高、抗干擾能力強，現已被廣泛應用于藥物、飲用水以及化工原料中環氧氯丙烷的檢測[11-12]。本研究就GC-MS 測定鹽酸普羅帕酮原料藥中基因毒性雜質環氧氯丙烷的可行性進行分析?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

GCMS-TQ8040NX 三重四級桿型氣相色譜質譜聯用儀（Shimadzu）；XPE205 電子天平（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

鹽酸普羅帕酮（生產企業：A，批號：01211206C）；環氧氯丙烷（Aladdin，批號：E108181，質量分數：99.5%）；實驗用水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：VF-624 ms（Agilent，30 m×0.25 mm，1.4 μm）；柱溫：程序升溫法，起始溫度40 ℃，維持2 min，再以10 ℃/min 的速率升溫至120 ℃，然后以30 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，維持3 min；載氣類型：高純氦氣；載氣流速：1.5 ml/min；進樣量：1.0 ml；分流比：5∶1；平衡時間：30 min；進樣方式：頂空進樣；平衡溫度：80 ℃。

質譜條件：離子源溫度：230 ℃；接口溫度：260 ℃；電離源：電子轟擊離子化（EI）；檢測器電壓：0.2 kv；選擇性離子模式（SIM）檢測，環氧氯丙烷特征離子質荷比（m/z）為49、57、62。見圖1。選擇響應最強的m/z 57 作為定量離子。

圖1 環氧氯丙烷特征離子

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液 精密稱取環氧氯丙烷32 mg，置100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，再精密量取上述溶液1 ml，移至100 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含環氧氯丙烷3.2 μg 的溶液。

2.2.2 對照品溶液a 精密量取2.2.1 項下制備的對照品儲備液1 ml，置于100 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含環氧氯丙烷32 ng 的溶液。

2.2.3 靈敏度溶液 精密量取2.2.2 項下制備的對照品溶液a 5 ml，置于50 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含環氧氯丙烷3.2 ng 的溶液，精密量取5 ml，置20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封。

2.2.4 供試品溶液 取鹽酸普羅帕酮原料藥約50 mg，精密稱定，置于20 ml 頂空瓶中，精密加入水5 ml，壓蓋密封，搖勻。

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線 分別取2.2.1 項下制備的對照品儲備液0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 和4.0 ml 置于6個100 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為系列對照品溶液。再依次精密量取上述各溶液5 ml，分別置于20 ml 頂空瓶中，壓蓋密封。進樣分析，以環氧氯丙烷濃度（ng/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，擬合曲線為y=867.08x+542.19，r=0.999 8。結果表明，環氧氯丙烷在4～128 ng/ml內線性關系良好。

2.3.2 檢出限和定量限 精密量取2.2.3 項下靈敏度溶液，稀釋3 倍作為定量限溶液，稀釋8 倍作為檢測限溶液。結果：定量限溶液信噪比為27.2，濃度為1.1 ng/ml；檢測限溶液信噪比為8.9，濃度為0.4 ng/ml。

2.3.3 精密度 精密量取2.2.2 項下制備的對照品溶液a 5 ml，置于20 ml 頂空瓶中，立即壓蓋密封，平行制備6 份，進樣分析，記錄色譜圖，計算環氧氯丙烷色譜峰保留時間與峰面積的相對標準偏差（RSD）值，結果分別為0.03%和1.9%，表明該方法儀器精密度良好。

2.3.4 加樣回收率 精密量取5 ml 低（16 ng/ml）、中（32 ng/ml）、高（64 ng/ml）濃度溶液，分別置于裝有50 mg 樣品的20 ml 頂空瓶中，立即壓蓋密封，各濃度平行制備3 份。見表1。

表1 環氧氯丙烷加樣回收率實驗結果

2.4 樣品測定

樣品中未檢出環氧氯丙烷。見圖2。結果表明，環氧氯丙烷含量符合規定（標準規定：環氧氯丙烷不得超過3.2 ppm）。

圖2 典型GC-MS/MS 色譜

3 討論

3.1 溶劑的選擇

本研究分別選用甲醇、水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜作為溶劑進行實驗，環氧氯丙烷響應為：二甲亞砜＞N,N-二甲基甲酰胺＞水＞甲醇，但以二甲亞砜和N,N-二甲基甲酰胺為溶劑時，背景干擾較大，且有機試劑毒性較大，環境污染性強，因此最終選擇水作為溶劑，由于鹽酸普羅帕酮極微溶于水，因此基本不影響環氧氯丙烷的測定。

3.2 進樣方式的選擇

實驗中選擇同一濃度對照品溶液，分別采用直接進樣和頂空進樣進行分析，頂空進樣響應明顯高于直接進樣。頂空進樣前處理簡單，可以減少待測物在萃取或浸提中的損失，且進樣量大，可相應增加響應，提高檢測靈敏度，同時可以避免試劑對色譜系統帶來的干擾和污染，延長色譜柱壽命[13]。

3.3 平衡條件的選擇

實驗中選擇32 ng/ml 的對照品溶液，在70、80、90 ℃平衡溫度下，分別孵育10 min、20 min、30 min、40 min，觀察峰面積的變化，結果顯示隨著孵育溫度的升高，峰面積逐漸增大。但因實驗中采用水作為溶劑，頂空平衡溫度接近其沸點時存在因內部氣體壓力過大而發生爆炸的危險[14]，因此最終選擇80 ℃作為頂空孵育溫度；同時，隨著孵育時間的增加，環氧氯丙烷的峰面積也逐漸增大，但當超過30 min時，峰面積變化明顯變緩，說明平衡時間達到30 min時，已基本實現氣液平衡。為提升工作效率，實驗中選擇30 min 作為最佳平衡時間。

3.4 結論

本實驗建立了鹽酸普羅帕酮中環氧氯丙烷的檢測方法，定量限為1.1 ng/ml，可滿足該原料藥中基因毒性雜質質控限度的要求。經各項實驗驗證表明，該方法操作簡便、專屬性強、靈敏度高、重復性好，且操作過程中不使用有機試劑，安全環保，適用于鹽酸普羅帕酮原料藥中環氧氯丙烷的分析，也可為鹽酸普羅帕酮制劑中環氧氯丙烷的檢測提供參考。