聯合化療的黃芪抗腫瘤給藥時間點的篩選

鄧曉霞 李清宋 李 影 劉素蘭

國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer, IARC）估算的數據[1]顯示，惡性腫瘤已超越心血管疾病等高死亡率慢性疾病，成為全球大多數國家和地區的第一或第二位死因。手術及放化療是目前腫瘤最常用的治療手段，三者常聯合使用[2]，但放化療的毒副作用較大[3-4]。

近年來，隨著對中藥的研究不斷深入，發現了一大批抗腫瘤藥物，研究其作用機制，為其臨床應用提供了重要的參考。應用中草藥治療和預防腫瘤成為全世界研究的熱點[5-7]。中醫藥以其安全、有效、低毒的特點在未來的抗腫瘤治療領域發揮著極其重要的作用[8-9]。

黃芪，味甘，性溫，歸肺、肝、脾、腎經，具有補氣升陽、固表止汗、托毒生津和利水消腫等功效，在臨床上常作為化療的輔助用藥[10-11]。臨床調研發現黃芪給藥具有很大的隨機性：放化療與黃芪同時使用或放化療后使用黃芪，臨床暫未對這兩種給藥方式的療效進行比較。放化療過程中黃芪的給藥時間點是否對其抗腫瘤療效有影響尚無定論。本研究就黃芪在腫瘤的化學治療中最佳給藥時間點進行分析?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

雄性昆明（KM）小鼠135 只，SPF 級，體重（20±2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2013-0004；H22 肝癌瘤株，由中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心藥理學科組提供。

1.2 藥物與試劑

黃芪顆粒，廣東一方制藥有限公司，批號：404021T；5-氟尿嘧啶（5-FU）注射液，上海旭東海普藥業有限公司，批號：FA150503；0.9%氯化鈉注射液，江西科倫藥業有限公司，批號：D15041604-1。

1.3 儀器設備

超純水儀，默克密理博 Milli-Q Advantage A10；十萬分之一天平，梅特勒，型號：MS205DU；EVC動物飼養裝置，蘇州猴皇動物實驗設備科技有限公司；BC-2800 全自動血細胞分析儀，深圳邁瑞有限公司；RM2255 型全自動輪轉式切片機，德國徠卡顯微系統有限公司；NiKon Ci-S 正置顯微鏡，日本尼康公司。

1.4 分組、造模及給藥

1.4.1 分組 135 只小鼠適應性飼養3 d 后，稱重，隨機分為9 組，每組15 只，分別為正常組（C 組）、模型組（M 組）、5-FU 組（25 mg/（kg?d））、化療同時給予黃芪高、中、低劑量組（5FU+Hh、5FU+Hm、5FU+Hl，5FU 劑量同上，黃芪5.6 g/（kg?d）、2.8 g/（kg?d）、1.4 g/（kg?d））、化療后給予黃芪高、中、低劑量組（5-FU 后+Hh、5-FU 后+Hm、5-FU 后+Hl，5FU、黃芪劑量同上）。小鼠飼養于室溫25 ℃，光照和黑暗各12 h 的標準化實驗室中。

1.4.2 造模 將肝癌細胞株H22 接種于健康KM 小鼠腹腔中，待其充滿腹水后無菌抽取含有H22 肝癌細胞的腹水，顯微鏡下調整細胞濃度為1.50×107個/ml，于小鼠右側前肢腋窩皮下注射0.2 ml 的H22 細胞懸液。

1.4.3 給藥 造模次日開始給藥。第1～7 天，C 組與M 組注射0.9%氯化鈉注射液，灌胃雙純水；5-FU組和化療后給予黃芪高、中、低劑量組注射5-FU，灌胃雙純水；化療同時給黃芪高、中、低劑量組注射5-FU，灌胃相應濃度的黃芪顆粒溶液。第8～14 天，C 組、M 組和5-FU 組灌胃雙純水，化療同時給黃芪高、中、低劑量組和化療后給予黃芪高、中、低劑量組灌胃相應濃度的黃芪顆粒溶液。1 次/d，連續給藥14 d，每隔1 天稱重1 次。造模后第3 天起，每隔1天測量腫瘤大小，腫瘤體積=1/2×a×b2，a 為長徑，b 為短徑。

1.5 動物處理、標本采集

實驗第14 天晚上禁食不禁水，次日眼球取血，后用頸椎脫臼法處死小鼠，快速剝取腫瘤組織、胸腺組織、脾臟，腫瘤組織存放于4%多聚甲醛中。胸腺指數（脾指數）=胸腺重量（脾臟重量）/小鼠體重×100%。

1.6 HE 染色

取出已在4.2%多聚甲醛中浸泡48 h 的腫瘤組織，用低速流動的自來水沖洗36 h，經過脫水-透明-浸蠟-包埋-切片后，HE 染色，光鏡下觀察各組腫瘤組織的病理變化。

1.7 全血檢測

將現取的血液用全自動血細胞分析儀檢測各組白細胞及淋巴細胞、中性粒細胞。

1.8 數據分析

采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以±s 表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芪對荷瘤小鼠一般狀況的影響

M 組有化膿和死亡現象，小鼠雙眼無神，反應遲鈍，皮毛稀少干枯，食量減少，且腫瘤生長迅速；5-FU 組有化膿和死亡現象，小鼠雙眼無神，反應和皮毛等未見明顯改善，活動度降低，瘤體較M 組有減小趨勢；5-FU+H 組和5-FU 后+H 組小鼠的生長狀況良好，無死亡現象，毛發有光澤，反應較靈敏，體重稍有增加，瘤體生長明顯減緩，但隨著時間的延長，5-FU 后+H 組小鼠的各項指標明顯優于5-FU+H 組。

2.2 黃芪對荷瘤小鼠體重的影響

M 組由于腫瘤生長迅速，荷瘤小鼠體重持續偏高；化療期間（前7 d），各給藥組荷瘤小鼠體重無明顯差異，平穩緩慢增加；化療結束后，各給藥組小鼠前期體重變化較小，隨著時間延長，荷瘤小鼠體重明顯增加，且給藥組中以5-FU 后+H 高劑量組、5-FU 后+H 中劑量組體重最高。從變化趨勢可推測出，在一定時間內，隨著時間的推移5-FU 組荷瘤小鼠的體重增加趨勢逐漸減緩，其他給藥組荷瘤小鼠體重穩步增加。見圖1。

圖1 黃芪對荷瘤小鼠體重的影響

2.3 黃芪對荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

與M 組比較，各給藥組小鼠腫瘤體積明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）；與5-FU 組比較，除5-FU 后+Hm 組（H 組）小鼠腫瘤體積明顯減小（P＜0.05）外，其他各組均無顯著差異。見圖2。故后續實驗主要針對H 組進行探究。

圖2 黃芪對荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

2.4 HE 染色

如圖3 所示：M 組腫瘤細胞核小、量大、色深，并大量向周圍組織（包括骨骼?。┣忠u，明顯破壞周圍組織，周圍組織中新生血管豐富；與M 組比較，5-FU 組、H 組的腫瘤細胞對周圍正常組織的侵襲程度依次逐漸減弱，新生血管依次逐漸減少，且H 組中形成了明顯的包膜、新生血管少且管徑小。

圖3 腫瘤組織HE 染色

2.5 黃芪對荷瘤小鼠胸腺指數、脾指數的影響

與M 組比較，5-FU 組胸腺指數和脾指數明顯下降（P＜0.05）；5-FU 組比較，H 組胸腺指數和脾指數明顯升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 黃芪對荷瘤小鼠胸腺指數、脾指數的影響

2.6 黃芪對荷瘤小鼠淋巴細胞、中性粒細胞的影響

與M 組比較，5-FU 組淋巴細胞顯著降低（P＜0.05）、中性粒細胞顯著升高（P＜0.05）；與5-FU 組比較，H 組的淋巴細胞顯著升高（P＜0.05）、中性粒細胞明顯降低（P＜0.05）。見圖5。

圖5 黃芪對荷瘤小鼠淋巴細胞、中性粒細胞的影響

3 討論

中醫認為肝癌屬于“肝積”“積聚”等病證范圍，其主要病機為正虛邪實、本虛標實。正如《諸病源候論》中言：“積聚者，乃陰陽不和，臟腑虛弱，受于風邪，搏于臟之氣所為也?！庇秩纭峨s病源流犀燭》言：“壯盛之人，必無積聚。必其人正氣不足，邪氣留著，而后患此?！闭f明正氣不足是腫瘤（疾?。┌l生的內在因素，是根本之所在；而外邪是誘發腫瘤（疾?。┑闹匾獥l件，是誘因；故扶正祛邪、攻補兼施為其主要治療原則[12]。

葉淑芳等[13]收集了于2019 年1—12 月在廣州市中西醫結合醫院就診的腫瘤患者的用藥處方，結果發現用藥頻次排名前15 的中藥以補氣藥和補血藥為主。黃芪作為最常見的抗腫瘤補氣藥之一，其抗腫瘤作用機制包括調節免疫、抑制腫瘤細胞轉移、促進腫瘤細胞凋亡、抗氧化等[14]。腫瘤大小是量化藥物是否具有抗腫瘤作用的基礎指標[15]。本研究綜合腫瘤大小及荷瘤小鼠生命質量探索黃芪聯合化療治療腫瘤的最佳給藥時間。研究發現，黃芪可改善荷瘤小鼠的生命質量，化療后給予黃芪可進一步抑制腫瘤的生長；HE 染色結果表明，黃芪可抑制腫瘤細胞增殖、減少血管新生及對周圍正常組織的侵襲。

5-FU 是目前常用的腫瘤化療藥物之一，效果顯著，但其嚴重的毒副作用-胃腸道反應（惡心、嘔吐）、免疫器官指數降低、免疫功能抑制、骨髓抑制等，亦不可忽視[3-4]。因此，提高免疫功能，增強機體自身抗腫瘤免疫反應在腫瘤治療中顯得至關重要。中性粒細胞是固有免疫系統中分布最廣泛的白細胞之一，是機體的第一道天然防線，既是炎癥形成的早期標志，還能參與機體免疫反應調節；淋巴細胞是體積最小的白細胞，具有免疫識別功能，通過啟動細胞毒性免疫反應抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移，是腫瘤細胞免疫反應中的關鍵細胞。胸腺和脾臟是機體重要的淋巴器官，其功能與免疫反應密切相關。本實驗通過剝離胸腺和脾臟，采集全血，獲得了胸腺指數、脾指數、中性粒細胞計數和淋巴細胞計數。結果表明，注射5-FU 后小鼠出現免疫功能低下狀態；化療后給予黃芪，胸腺指數、脾指數、淋巴細胞明顯升高，中性粒細胞明顯降低，說明黃芪可改善5-FU 引起的免疫功能降低、炎性環境。

綜上所述，黃芪可增強5-FU 的抗腫瘤作用，且化療后給予黃芪效果更加明顯，其抗腫瘤作用可能與黃芪能增強機體免疫功能、抑制腫瘤細胞增殖、減少血管新生、改善炎性環境有關。