p53 活性四聚體全原子分子動力學分析*

周晗 耿軼釗 晏世偉3)

1) (北京師范大學物理學系,北京 100875)

2) (河北工業大學理學院,天津 300131)

3) (北京師范大學文理學院,珠海 519085)

p53 是一種腫瘤抑制蛋白,對阻礙癌癥發展、維持遺傳完整性起著至關重要的作用.在細胞核內,4 個p53 分子通過高度協同的方式、通過DNA 結合域與DNA 結合,形成穩定的四聚體活性結構,并轉錄激活或抑制其靶向基因.然而,大多數腫瘤細胞中存在大量p53 的突變,其中絕大部分突變發生在p53 的DNA 結合域,而p53 的DNA 結合域又是p53 形成四聚體活性結構、調控下游靶基因轉錄的重要區域.本文通過全原子分子動力學模擬,研究了野生型p53 四聚體內分子間的相互作用機制.結果表明,位于DNA 兩側的對稱二聚體是一個穩定的二聚體,在與DNA 結合前后都能維持穩定的結構.位于DNA 同側的兩個單體依靠兩個接觸面提供的蛋白-蛋白相互作用和DNA 的骨架作用使四聚體活性結構保持穩定,這些相互作用為四聚體的形成機制提供了重要支撐.該工作厘清了p53 四聚體在動力學過程中的內部相互作用機制和關鍵殘基,揭示了四聚化過程中各個相互作用界面的關鍵位點,對于理解p53 的抑癌機制、探索有效治癌策略、發展治癌藥物具有重要意義.

1 引言

p53 腫瘤抑制基因是最常見的癌變相關基因之一[1].在應激環境下,p53 蛋白主要作為一種轉錄因子,促進下游靶基因的轉錄[2],從而引起細胞周期停滯、損傷修復或細胞凋亡[3,4].在人類癌癥中超過50%的腫瘤細胞中發現有p53 突變[5,6],其中錯義突變廣泛發生在p53 的核心結合域,約占所有p53突變的95%[7].這種突變不但直接影響了p53 與DNA 的結合親和力,也會不同程度地影響其正確折疊[8],這對靶基因的轉錄和細胞凋亡水平有很大的影響.因此,p53 是腫瘤治療中的關鍵靶點.在針對p53 的靶向治療中,有兩種治療策略: 一種是針對野生型p53,利用化合物占據MDM2 蛋白的活性位點,抑制MDM2 蛋白介導的p53 泛素化和核輸出[9–11];另一種是針對發生突變的p53,利用化合物結合,誘導突變型p53 的重新激活,恢復野生型功能[12].無論哪一種治療策略,都需要對p53 野生型結構的分子特征有清晰的認識.

穩定的p53-核心結構域(p53 DNA binding domain,p53-DBD)在細胞核內形成四聚體[13](見圖1),與特異性靶DNA 結合并調節基因轉錄,誘導下游信號通路的改變.p53 核心結構域的四聚化是p53 作為一個轉錄因子的生物學功能核心.對于p53-DBD,各種結晶實驗已經得到了p53 識別DNA 的分子機制[14].p53-DBD 與DNA 的結合主要包括兩個結合槽,其中,環-片-螺旋基序(loopsheet-helix motif,LSH)與主槽對接,通過關鍵殘基K120,C277,R280,R285,A276,S241和R273 與DNA 形成氫鍵.來自環L3 的殘基R248 與小凹槽相互作用形成氫鍵.這些相互作用使得p53 可以與DNA 穩定的結合.核心結構域與DNA 的復合物晶體結構也解釋了各種突變體如何使其失活,并在結晶實驗和分子動力學模擬中得到了大量的證實[8,15,16].然而,游離的p53-DBD 主要以單體形式存在于溶液中[17],不易與DNA 的單一四分之一位點結合.顯然,它需要一種更穩定的結合方式,才能夠使p53 發揮其轉錄激活功能.

圖1 p53 核心結合域四聚體結構: A 鏈(藍色);B 鏈(紅色);C 鏈(綠色);D 鏈(橙色).藍線表示對稱二聚體界面,紅線表示二聚體-二聚體界面Fig.1.The p53 core binding domain tetramer structure:Chain A (blue);Chain B (red);Chain C (green);Chain D(orange).Blue lines represent symmetric dimer interfaces,while red lines represent dimer-dimer interfaces.

實驗結果表明,p53-DBD 主要以一種高度協同的方式結合DNA 一致序列[18].兩個p53-DBD相對于DNA 以對稱的形式結合DNA 的半位點形成對稱二聚體結構(symmetrical dimer structure).Nicholls 等[19]在研究p53 的體外生物發生實驗中進一步證實,p53 二聚體是通過共翻譯形成的,這種二聚體是位于DNA 兩側的二聚體.實驗上對對稱二聚體的結構已經有了比較清楚的描述: 對稱二聚體(圖1 中的A-B 和C-D)中的蛋白接觸界面,被稱為對稱界面.它由每個p53 分子的H1 螺旋殘基、Zn 配位體以及L2 和L3 環區域形成環-片-螺旋基序.疏水作用和由水介導的極性相互作用穩定了對稱二聚體[20].然而有實驗表明,對稱二聚體仍可能在一定時間后從DNA 上脫離[21,22].

為了保持p53-DBD 與DNA 的穩定結合,兩個對稱二聚體(A-B 和C-D)通過蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction)和堿基堆疊作用,在一個完整的DNA 響應元件上構成一個四聚體[13,20,23].隨著兩個對稱二聚體之間接觸點的增加,四聚體與DNA 的配合物更加穩定,半衰期與親和度有很大提高[24].Weinberg 等[22]進行了野生型p53 四聚體和一個只能形成二聚體的L344A 突變體的對比實驗.結果表明,四聚體對DNA 的親和力是二聚體的6 倍.由此可見,核心結合域與DNA的四聚體配合物是p53 行使功能的關鍵,而二聚體-二聚體相互作用則在二聚體組裝成四聚體的過程中起著十分重要的作用.

迄今為止,相繼出現了一系列關于p53-DBD四聚體結構的實驗結果[14,20,24–26],著重分析了四聚體分子中A-DNA,B-DNA 和A-B 之間的結構和相互作用.對于DNA 同側A-D 和B-C 之間的蛋白-蛋白相互作用卻鮮有分析.目前,對這些蛋白-蛋白相互作用的細節和結構的認識還相當匱乏.Cho 等[14]得到的不對稱的p53-DBD 三體結構中,由于處于DNA 同側的B,C 鏈結合的是非一致序列,導致B-C 之間的相互作用非常微弱.此外,在Kitayner 等[20]描述的p53 四聚體中,由于DNA不連續導致的錯位,使得兩個對稱二聚體之間幾乎沒有蛋白-蛋白相互作用.然而,如前所述,在四聚體的結構中,二聚體-二聚體之間的相互作用是不可或缺的.

為了分析和研究p53 四聚體中位于DNA 同側和對側的兩種蛋白-蛋白相互作用,利用全原子分子動力學模擬方法分別對這兩種相互作用進行了系統分析.晶體結構選擇Chen 等[23]提出的一種自組裝的p53 四聚體結構(PDB ID: 3KMD).這一結構能夠保證p53 四聚體可以結合到一個連續的同源DNA 位點,且DNA 不會彎曲.如圖1所示,結構中每個p53-DBD 單體都與DNA 的一致序列結合.p53 四聚體內包含以下3 類接觸面:1) p53-DNA 接觸面;2) p53 對稱二聚體接觸面(A-B,C-D,藍色線);3)二聚體-二聚體接觸面(AD,B-C,紅色線).由于DNA 兩側的p53 是對稱分布,即A-B 和C-D 接觸面一致,A-D 和B-C 接觸面一致,所以本文將這個體系分為兩部分進行模擬:1)由單體A,B 和DNA 組成的對稱二聚體模型;2)由A,D 和DNA 組成的二聚體-二聚體界面模型.本文還分別計算了在沒有DNA 結合時,兩種模型的二聚作用,分析兩種二聚模式是否都需要DNA才能穩定,以及DNA 在兩種二聚體中的作用.

在本文模擬計算中,使用Amber14SB 和OL15力場分別模擬p53-DBD (殘基92-291)和DNA.Zn 離子與4 個殘基配位體(C176,C238,C242 和H179)結合.采用Lu 等[32]研究工作中的參數,對Zn 離子的四配位體進行描述.將整個結構在TIP3P 水分子的立方盒子中溶劑化,采用所有原子與水盒邊緣之間最小距離為12 ? (1 ?=10–10m)的原則,防止周期性邊界條件造成不同盒子內的分子有相互作用.通過添加0.15 mol/L 的Na+和Cl–來中和系統.使用Gromacs2018[33]來執行分子動力學模擬.靜電相互作用使用離子網格Ewald(PME)方法來處理,實際空間截止距離為1.2 nm.范德瓦耳斯相互作用(van der Waals interaction)計算的截止距離為1.2 nm.使用 V-rescale 方法的外部溫度浴使溶質和溶劑保持恒溫,壓力浴使用Parrinello-Rahman 方法維持恒壓,溫度和壓力保持在310 K 和1 Pa.使用Verlet 緩沖區每10 步更新一次,截止距離為1.2 nm.首先采用共軛梯度法最小化5000步,以消除空間沖突.并先后在NVT和NPT 條件下進行0.1 ns 的模擬,以平衡系統.文中所有結構均采用VMD 軟件[34]進行可視化處理.

本文首次揭示了四聚體中位于DNA 對側和同側的兩種二聚形式在“有”和“無” DNA 結合時的構象差別和相互作用變化,得到各個p53 單體間協同結合的分子機制,并且證明這兩種二聚形式的模擬,可以復現p53-DBD 四聚體中的兩種蛋白-蛋白相互作用.系統地分析p53-DBD 四聚體的內稟屬性,有助于開發針對p53 的抗癌性藥物,例如恢復錯誤折疊的突變型p53 的野生型功能,促進其重新折疊成野生型p53 等.

2 對稱二聚體內的相互作用

p53-DBD 的四聚體結構是通過兩個對稱二聚體的蛋白-蛋白相互作用形成的.因此,首先分析對稱二聚體中分子之間的作用機制,分別對p53 對稱二聚體在“有”和“無”DNA 結合的體系進行200 ns的分子動力學模擬,以研究p53 對稱二聚體在動力學過程中的相互作用.如圖2 所示,選擇晶體結構(PDB ID: 3KMD)中的A,B 鏈和DNA 構成的對稱二聚體作為模擬的初始結構(后文稱為“有”DNA 結構).為了分析DNA 的作用,在圖2 的結構中剪去DNA 分子,構成“無”DNA 對稱二聚體的初始結構(圖3).

圖2 p53 對稱二聚體與DNA 復合物的初始結構(a)由A,B 鏈和DNA 組成的p53 對稱二聚體結構;(b) Zn 離子的配位結構;(c) DNA 軸垂直于圖平面的對稱二聚體Fig.2.Initial structure of the p53 symmetric dimer-DNA complex: (a) The p53 symmetric dimer structure composed of chains A,B and DNA;(b) coordination structure of Zn ions;(c) symmetric dimer with the DNA axis perpendicular to the plane of the figure.

圖3 “無”DNA 的p53 對稱二聚體初始結構Fig.3.Initial structure of the p53 symmetric dimer without DNA.

2.1 對稱二聚體結構的穩定性

首先,計算了這兩組模擬中p53 對稱二聚體的主鏈碳原子相對于其初始時刻的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD),以檢驗模擬的收斂性以及DNA 的存在對二聚體結構穩定的影響.如圖4 所示,經過20 ns 的模擬后,兩個p53 對稱二聚體都達到穩定.因此,選擇20—200 ns 的穩定軌跡進行分析.與有DNA 結合時的二聚體的RMSD (約(0.1791±0.0159) nm)相比,沒有結合DNA 時二聚體的RMSD 平均值和漲落(約為(0.2935±0.0576)nm)較大.所以,沒有DNA結合的情況下,p53 對稱二聚體表現出更大的構象變化和更低的穩定性.這說明,與DNA 的結合可以限制二聚體的構象變化,增強二聚體穩定性.另外還通過計算A,B 兩個蛋白的溶劑可及表面積,得到了A,B 兩個蛋白單體之間的埋沒表面積,即二聚體接觸面積.在有DNA 的對稱二聚體中,接觸面積為425.76 ?2.在除去DNA 之后,接觸面積為416.38 ?2,說明DNA 的結合不會對二聚接觸界面的大小有太大影響,即對稱二聚界面是一個比較穩定的界面.

圖4 對稱二聚體在“有”和“無”DNA 結合時的RMSD 演化Fig.4.Evolution of RMSD for the symmetric dimer with and without DNA.

為了更深入地理解DNA 結合對對稱二聚體內相互作用的影響,對兩個p53 單體之間的相互作用進行分析,如圖5 所示.以供體原子X與受體原子Y之間的距離小于3.5 ?,并且X-氫-Y三個原子形成的角度小于30°,作為判定原子X-Y形成氫鍵的標準[35].當帶負電荷的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)側鏈COO–[36]與帶正電荷的精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys)側鏈或原子之間的最小距離小于4 ?時,判定兩殘基間形成鹽橋.本文的結論是持續度大于20%的氫鍵和鹽橋.A-B單體間的相互作用分析表明,兩單體之間沒有形成氫鍵,靜電相互作用是由E180 和R181 間的鹽橋構成.與DNA 結合時,來自E180(A)-R181(B)和R181(A)-E180(B)的兩個鹽橋,持續度分別為82.07%和50.53%.在除去DNA后,這兩個鹽橋的持續度有所變化,持續度分別為43.59%和70.51%.這些結果表明,在DNA 結合前后,位于A-B 單體H1 螺旋上的E180 和R181 間形成兩個鹽橋,一個穩定性較強,一個穩定性較弱,兩個鹽橋的疊加對二聚體中的靜電相互作用有很大的貢獻.

圖5 A-B 單體間的相互作用殘基(a) A-B 單體間形成鹽橋的殘基;(b) A-B 單體間參與范德瓦耳斯作用的殘基Fig.5.Residues involved in interactions between A and B monomers: (a) Residues forming salt bridges between A and B monomers;(b) residues involved in van der Waals interaction between A and B monomers.

為了分析與DNA 結合前后對稱二聚體的親和力變化,采用分子力學/泊松-玻爾茲曼表面積(molecular mechanics/Poisson Boltzmann surface area,MM/PBSA)算法[37]計算對稱二聚體的結合自由能.在無DNA 結合的情況下,二聚體的結合能為–23.84 kcal/mol.在與DNA 結合后,二聚體的結合能為–22.60 kcal/mol.表明在有無DNA 結合時,對稱二聚體的親和力是相似的,這與我們的靜電相互作用分析結果一致.2.2 節將說明,這種結合能差異來源于DNA 分子的支撐作用.通過對A-B 間結合能的殘基分解,得到了二聚作用的殘基貢獻分布.圖6 列出了兩個體系中殘基貢獻絕對值大于1 kcal/mol 的殘基,一般認為對復合物結合的能量貢獻大于1 kcal/mol 的殘基是關鍵殘基.由于A-B 單體在DNA 兩側對稱分布,所以兩個p53 單體的殘基貢獻差別很小.

圖6 與DNA 結合前(a)后(b)對稱二聚體的殘基能量貢獻分布Fig.6.Residue energy contribution distribution of symmetric dimers with (a) and without (b) DNA.

由圖6 可以發現,在與DNA 結合前后,對稱二聚體結合的關鍵殘基完全一致,共有6 個關鍵殘基,分別為來自H1 短螺旋的P177,H178,H179,E180,R181 和來自L3 環的M243.E180 和R181 參與了靜電相互作用.P177,H178 和M243 雖未參與靜電相互作用,但P177(A)-P177(B),H178(A)-M243(B)和M243(B)-H178(A)之間緊密接觸,參與了范德瓦耳斯相互作用(VDW).兩個H179 殘基各自包含一個Zn 離子,提供了靜電相互作用.在這6 個殘基中,有4 個殘基在A-B 二聚體中的能量貢獻都很接近.但是,來自兩個p53 單體中的E180 和R181 的貢獻有明顯的差別.這是由于DNA 的結合導致的構象差別造成的.在DNA 結合時,E180(A)-R181(B)鹽橋更穩定.而除去DNA后,R181(A)-E180(B)鹽橋更穩定.二聚作用的關鍵殘基中,有4 個殘基位于Zn 離子的配位體附近(P177,H178,H179 和M243),所以Zn 離子的穩定將會影響二聚體的穩定性.如果在Zn 離子周圍的殘基發生了突變[38],將會對二聚體的穩定性產生影響.

1.3.5 體表光學監測 經1.3.4行誤差校正后，啟動OSMS軟件，再次掃描面部，靜態獲取新的體表參考影像Vision RT影像，在機架及影像臂不遮擋攝像頭條件下采集與參考影像比對后獲得的影像偏差值，3次采集監測數值均值記錄為當次影像偏差值。按照治療計劃參數進行出束治療，同時啟動OSMS軟件監控面部位置變化，以Vision RT影像監測當次分次內治療，位置變化超過誤差允許值2 mm，加速器出束治療被暫停，否則繼續出束治療，采集3次監測數值均值記錄為當次影像偏差值，治療結束再次重復CBCT位置驗證，得到治療靶區位置誤差并記錄。

本文結果表明,除去DNA后,A-B 二聚體的結合狀態幾乎沒有發生改變,短時間內不會由于DNA 的缺失而變構.前期的很多研究工作都表明,二聚體是通過疏水和極性相互作用來穩定的[20].NMR 結果顯示H1 螺旋(P177-C182)在二聚過程中起到重要作用[39].通過X 射線晶體學確定的小鼠p53 二聚體結構中[26],由R181 和E180 形成了兩對鹽橋,M243 與水介導形成氫鍵,R177 與H178廣泛參與了范德瓦耳斯接觸.這些實驗結果與我們的模擬結果是一致的.然而,目前實驗上尚沒有得到無DNA 結合情況下的對稱二聚體結構[18].

2.2 DNA 分子的作用

對p53-DNA 間的相互作用分析表明,A,B 單體與DNA 結合的關鍵殘基基本一致.如圖7 所示,來自環片-螺旋基序的殘基K120,R280,A276,R273 和S241 與主槽結合,環L3 上的R248 與次凹槽結合.唯一不同的殘基是S121,它在單體A 中與DNA 主鏈結合形成氫鍵,而在單體B 中沒有與DNA 形成氫鍵.

圖7 對稱二聚體與DNA 結合的關鍵殘基.黃色殘基表示A,B 單體與DNA 結合的一致殘基,綠色表示與DNA結合不一致的殘基Fig.7.Key residues involved in the binding of the symmetric dimer to DNA.Yellow residues represent consistent residues between monomers A and B and DNA binding,while green residues represent inconsistent residues with DNA binding.

下面分別計算了p53 單體、對稱二聚體與DNA的結合自由能.對稱二聚體與DNA 的結合能(–147.64 kcal/mol)約為p53 單體與DNA 結合能(–70.47 kcal/mol)的兩倍,正是這種能量貢獻,使得p53 不是以單體與DNA 結合的方式進行轉錄激活.同時還發現,相比于蛋白-蛋白之間的結合,p53 蛋白與DNA 間的相互作用是更加牢固的.所以,DNA 是對稱二聚體形成和穩定的關鍵因素.如前所述,實驗上尚未發現無DNA 結合下的對稱二聚體的穩定結構[18],這里給出結合能的計算結果,提供了一種可能的解釋,我們推測對稱二聚體的形成應該是一種接受到轉錄信號后的協同作用.

通過能量分解,能量貢獻最大的3 個殘基是R273,R248,R280 (殘基結合貢獻大于 6 kcal/mol).而這3 個殘基正是p53 突變的熱點殘基(R248Q,R248W,R273H,R273C,R280K).這些突變型屬于接觸型突變,即這些殘基位于DNA 結合位點上,突變會導致p53-DBD 失去結合DNA 的能力、p53-DBD 不同程度的構象變化以及DNA 結合表面的結構重排[40,41].與此同時,這些突變的p53 蛋白具有致癌潛力.它們可以以顯著負性的方式抑制任何剩余的野生型p53,也可以獲得促進腫瘤生長、侵襲、轉移和化療耐藥性的新功能[42].

3 二聚體-二聚體界面的相互作用

迄今為止,實驗上得到的p53 核心結構域包括野生型和突變型單體、二聚體,以及各種四聚物結構.然而,位于DNA 同側的二聚體結構還沒有發現.為了探究位于DNA 同側的二聚體在生理環境下的構象特征,從p53 四聚體中提取出單體A,D 和DNA 的結構(圖8)作為初始結構,對“有”和“無”DNA 結合的A-D 二聚體分別進行200 ns 的分子動力學模擬.由于在四聚體中DNA 兩側的p53 是對稱的,兩個蛋白-蛋白相互作用界面也完全一致,所以選擇DNA 一側的A-D 二聚體就可以很好地描述二聚體-二聚體相互作用.

圖8 由 A,D 和DNA 組成的復合物初始結構Fig.8.Initial structure of composite molecule including A,D and DNA.

3.1 無DNA 結合的A-D 二聚體不是一種合理的結構

首先對有/無DNA 結合時A-D 二聚體的結構構象進行對比.通過動力學軌跡可以發現,與DNA結合時,A-D 二聚體接觸界面與晶體結構相似,而無DNA 結合時,A-D 接觸界面由原來的兩個接觸面變成一個接觸面,如圖9(c)和圖9(d)所示.通過計算A-D 兩單體質心間距,發現當沒有DNA結合時,兩個單體質心間距變小.在初始時刻,A-D單體的質心間距為35.524 ?.通過計算兩個體系穩定后A-D 的質心間距的概率密度分布(圖9(a))可以看出,與初始時刻相比,無DNA 結合時,AD 單體的質心間距更小(最可幾值為33.925 ?).與DNA結合后,兩單體的質心間距有微小的增大(最可幾值為36.623 ?).圖9(b)顯示了兩個體系穩定后二聚界面接觸面積的概率密度分布.從圖9(c),(d)可以明顯看到,在與DNA 結合的A-D二聚體內,二聚體的接觸面積較小(380.2544 ?2),這是由于DNA 結合下的A-D 二聚體共形成兩個接觸面.而除去DNA后,單體由于相互作用逐漸靠近,兩個接觸面間的空腔逐漸消失變為一個接觸面,接觸面積增加了2.1 倍(830.1783 ?2).這種構象上的變化會使得相互作用區域發生改變,從而影響A-D 二聚體的構象.

圖9 有/無DNA 結合時,A-D 二聚體構象上的差別(a) A,D 兩個單體質心間距的概率密度分布;(b) A,D 分子間接觸面積的概率密度分布;(c)有DNA 的A,D 分子間二聚接觸面;(d)無DNA 的A,D 分子間二聚接觸面Fig.9.Differences in the A-D dimer conformation with/without DNA binding: (a) Probability density distribution of the distance between the centers of mass of A and D monomers;(b) probability density distribution of the interfacial contact area between A and D molecules;(c) dimeric contact area between A and D molecules in the presence of DNA;(d) dimeric contact area between A and D molecules in the absence of DNA.

如圖10(a)所示,從RMSD 的時間演化曲線可以看出,在沒有DNA 結合的A-D 二聚體中,兩單體在120 ns 后逐漸達到穩定,RMSD 值在(0.5634±0.0391) nm 處穩定.單體A,D 的RMSD 分別穩定于(0.2983±0.0177) nm 和(0.2177±0.0143) nm附近.與對稱二聚體的結果(圖4)相比,無DNA結合的A-D 二聚體的穩定需要更長的時間,且AD 二聚體的構象變化更大.在120 ns 附近A-D 二聚體的RMSD 有明顯的升高.分別計算了105—120 ns 和120—135 ns 軌跡的平均結構并進行重疊,結果如圖10(b)所示,可以看出,120 ns 后單體A 整體向左上方移動,單體D 向右后方移動,這會導致分子間接觸面相互作用發生改變.單體間的移動使得單體D 的L6 區域和單體A 的L7,L5'區域更加靠近,從而形成了更多的相互作用.例如,在120 ns后,位于L6 的G224,S227分別與L5'上的N210 形成新的氫鍵,位于L6 的V225 分別與位于L7 上的N263 和L264 形成新的氫鍵.

圖10 (a)無DNA 結合時A-D 二聚體 的RMSD演化;(b) 120 ns 前后A-D 二聚體的構象重疊,兩單體的構象發生了明顯的偏移,使得A-D 之間的相互作用增加.120 ns前后的構象分別用銀色和橙色表示Fig.10.(a) RMSD evolution of the A-D dimer in the absence of DNA binding;(b) at around 120 ns,there is an overlap in the conformation of the A-D dimer,with noticeable deviations in the conformations of the two monomers,leading to an increased interaction between A and D.Conformations before and after 120 ns are represented in silver and orange,respectively.

對接觸界面的相互作用分析表明,穩定后的A-D 二聚界面大約有8 個氫鍵和2 個鹽橋,穩定性分析見表1.這些氫鍵和鹽橋分別來自R267-D228(鹽橋),R209-E224 (鹽橋),S94-L201,N210-D228,S94-G199,L264-V225,S99-D228,S96-T231,N263-V225 和N210-S227 (左側為單體A 的殘基號,右側為單體D 的殘基號).這與晶體結構中A-D 單體間的相互作用完全不同.從結構和相互作用分析上來看,無DNA 結合的A-D 二聚體變為一種結合更為緊密的二聚形式.然而,這種結合更緊密的A-D二聚體卻不是一種合理的結構.將無DNA 結合時的模擬結果與有DNA 的結構進行重疊,如圖11所示,除了A-D 接觸界面的變化外,上述形成的無DNA 結合的穩定的A-D 二聚復合物(圖9(d))已經不能與連續的同源DNA 序列結合.因此,在生理環境下,沒有DNA 結合時,位于DNA 同側的二聚體不能保持合理的構象,這不利于p53-DBD 四聚體的形成.這也解釋了為什么在四聚體的形成過程中,優先形成對稱二聚體.

表1 氫鍵、鹽橋穩定性Table 1.Hydrogen bond and salt bridge stability.

圖11 無DNA 時的A-D 二聚體不能與DNA 結合Fig.11.A-D dimer can’t bind to DNA in the absence of DNA.

那么,這是否說明游離的p53-DBD 會產生很多不合理的寡聚呢？答案是否定的.因為在體內,p53-DBD 除了與DNA 形成四聚體的有效功能外,還會和其他蛋白之間存在蛋白-蛋白相互作用[43–45],這些相互作用使得p53 能夠通過多種途徑調控腫瘤發展.與此同時,A-D 二聚體與DNA 的復合物能夠保持與晶體結構相似的構象狀態,說明DNA在其中起到了重要作用,下面將詳細分析DNA 在A-D 二聚體中的作用.

3.2 DNA在A-D 二聚體中的骨架作用

3.1 節計算了有/無DNA 結合時A-D 單體間的質心距離,發現在沒有DNA 結合時,A-D 單體質心間距相對較小;而有DNA 結合時A-D 單體間質心距離相對較大.為了分析產生這一現象的原因,在有DNA 結合時的A-D 二聚體 200 ns 得到的分子結構中剪去DNA 分子,采用傘形取樣方法[46],得到應用在A-D 分子上的彈性應力,此力原則上與DNA 分子的作用相同,抵消了A-D 分子間的靜電力和范德瓦耳斯力,從而保持A-D 分子間一定的空間距離不變.具體來說,在與DNA 結合的A-D 二聚體中,平衡后兩單體的平均質心間距為3.6109 nm,以此平衡結構作為初始結構,剪去DNA分子,對A-D 二聚體采用傘形取樣的方法,設置A-D 質心的參考距離為 3.6109 nm,進行 10 ns 的模擬,得到相應的彈性應力,如圖12(a)所示.在模擬初期,由于兩單體質心間距大于參考距離,所以兩單體之間的彈性應力的方向沿著質心軸向內,而在 4.5 ns后,質心距離小于參考距離,所以彈性應力的方向沿著質心軸向外,最終彈性應力穩定在一個確定的大小.

圖12 (a)二聚體上的彈性應力;(b)穩定后,彈性應力作用下A-D 二聚體的結構Fig.12.(a) Elastic stress on the dimer;(b) structure of the A-D dimer under the action of elastic stress after stabilization.

如圖12(b)所示,在此情況下,A-D 單體間形成兩個清晰的接觸面.接觸面1 上有兩條穩定氫鍵,分別為T170(A)-G199(D)和S166(A)-H233(D).接觸面2上,S99(A),R267(A)與V225(D)之間形成穩定性較弱的氫鍵.與實驗得到的結晶結構相比,雖然相互作用殘基有所差別,但是相互作用區域是一致的.本文的結果表明,與DNA 結合時,A-D單體各自與DNA 的一致序列結合,DNA 分子提供骨架的支撐作用,使A,D 單體保持一定的空間距離.DNA 分子的支撐作用是DNA 同側二聚體穩定的一個關鍵機制.

3.3 與DNA 結合的A-D 二聚體

A-D 二聚體可以在與DNA 結合時,保持合理的構象狀態,對這個體系的穩定性和相互作用進行細致分析,探究在DNA 同側的單體在動力學過程中的相互作用特點.首先,對與DNA 結合的A-D 二聚體的穩定性分析表明,p53 A-D 二聚體的RMSD在 120 ns 后達到穩定(約(0.3231±0.0194)nm),如圖13(a)所示.此外,單體D在150 ns 后才達到穩定,單體D 的RMSD 穩定在(0.3505±0.011) nm,且在90—150 ns 期間有明顯上升,如3.1 節中的分析,說明在這個時間前后單體D 存在構象變化.

圖13 有DNA時,A-D 二聚體 的穩定 性(a) RMSD;(b) RMSFFig.13.Stability of A-D dimer in the presence of DNA:(a) RMSD;(b) RMSF.

通過計算殘基的均方根波動(root mean square fluctuation,RMSF),可以得到各個殘基的靈活性情況.如圖13(b)所示.A,D 兩單體的RMSF 趨勢總體上是一致的,但單體D 的RMSF 在殘基92—94 處明顯增大.這是由于此區域正處于p53-DBD區域的結構邊緣,此模型忽略了p53 的1—91 號殘基(N 端)和292-393 (C 端)殘基的影響.在除去92—94 這3 個殘基的影響后,單體D 也在 20 ns后一直保持穩定(圖13(a)紫色線).這表明92—94段殘基的靈活性增強并不會影響單體D 其他區域的穩定.而在單體A中,92—94 殘基區域正處于p53 A-D 二聚界面上,參與了蛋白-蛋白相互作用,所以,單體A 的N 端區域沒有靈活性增強的情況.此外,在186—225 殘基區間,發現A,D 單體的個別殘基(186,187,198 和225 等)靈活性有差別,這是由于這些殘基位于p53 A-D 二聚接觸界面的環路上,由于兩個單體是平行分布的,所以位于邊緣的環路受到的約束更少,導致殘基的靈活性更大.

對p53 A-D 二聚體界面的相互作用分析表明,A-D 單體之間存在兩個接觸面.在兩個接觸面上存在鹽橋和豐富的氫鍵網絡,所有氫鍵和鹽橋的穩定性分析見表2.如圖14 所示,位于接觸面1 上的T170(A)-G199(D)形成一條穩定氫鍵,P92(A)-D186(D)之間形成兩條穩定性很弱的氫鍵.位于接觸面2 上的K101(A),分別與D 鏈的E224 形成穩定鹽橋,與P222,P223 形成不穩定的氫鍵.接觸面2 上還有一條不穩定氫鍵,來自Q100(A)-P223(D).結果表明,與接觸面2 上的復雜相互作用相比,接觸面1 上的氫鍵更穩定,更簡單.而接觸面2 上的殘基參與的相互作用更復雜.P222,P223 和E224位于L6環,P92,K101 位于N 端無序區域,這些區域的靈活性較強,導致接觸面2 的相互作用穩定性也較差,這也促使某些殘基參與了更多的相互作用(如K101).此外,T170 和D186 位于L2 環上,G199 位于L5 環上,表明L2,L5,L6 以及N 端無序區域是A-D 二聚體內靜電相互作用的關鍵區域.

表2 與DNA 結合時A-D 二聚體間的氫鍵、鹽橋穩定性Table 2.Stability of hydrogen bonds and salt bridges between A-D dimers when binding to DNA.

圖14 與DNA 結合的A-D 二聚體間的(a)接觸面和(b)相互作用殘基Fig.14.Contact surface (a) and residues involved in the interaction (b) between the A-D dimer bound to DNA.

p53 的每個單體都與DNA 間形成廣泛的氫鍵網絡.單體A 和單體D 與DNA 間平均有12 和11條氫鍵.如圖15 所示,對于單體A,K120,A276,R283,R280,R273,N239,N288 和S241 與主凹槽相互作用,其中R280 深深地插入主凹槽,形成2 條穩定的氫鍵.R283,S241 和K291 只在單體A 中與DNA 形成氫鍵,而在單體D 中沒有.R248 和K291與次凹槽形成穩定的氫鍵,但R248 并未插入到凹槽內部,而是與DNA 主干形成3 條氫鍵.對于單體D,K120,A276,N239,R280,R273,N288 和S121與主凹槽相互作用.與單體A 不同的是與主凹槽相互作用的殘基增加了S121,與主凹槽形成兩條氫鍵.R248 與次凹槽形成穩定的氫鍵.結果表明,A-D 兩單體與DNA 形成的氫鍵網絡和各氫鍵的穩定性是有差別的,單體A 中S241 貢獻了一條穩定性最強的氫鍵,在單體D 中沒有出現.相反,單體D 中由S121 貢獻了兩條穩定的氫鍵,在單體A中則沒有.這些相互作用確保了A,D 單體與DNA的穩定結合,表明A-D-DNA 的復合物分子也是一個穩定的結構,可以正確描述四聚體中的結構特點.

圖15 單 體A,D 與DNA 間相互作用的 關鍵殘基.黃色殘基表示A,D 單體與DNA 結合的一致殘基,綠色表示與DNA 結合不一致的殘基Fig.15.Key residues involved in the interaction between monomers A and D with DNA.Yellow residues represent consistent residues between monomers A and D and DNA binding,while green residues represent inconsistent residues with DNA binding.

通過結合自由能計算,在DNA 結合狀態下,A-D單體間的結合能為–17.17 kcal/mol,與2.2 節給出的對稱二聚體的結合能(–22.60 kcal/mol)相比較小.因此,相對于對稱二聚體,A 與D 單體之間相對結合較弱,這一結果與實驗給出的結論是一致的.結合能的殘基分解如圖16 所示,A-D 二聚體的關鍵殘基包括來自單體A 的L93,K101,Q167和來自單體D 的D186,L201.如前所述,K101(A)和D186(D)分別參與了靜電相互作用.L93(A)-G199(D),L93(A)-E171(A),Q167(A)-H233(D),S94(A)-L201(D)和S95(A)-L201(D)之間形成范德瓦耳斯相互作用.

圖16 與DNA 結合的A-D 二聚體的能量分解Fig.16.Energy decomposition of the A-D dimer binding to DNA.

在結晶實驗中得到的p53-DBD 四聚體結構[23],DNA 同側的兩單體間有大量的范德瓦耳斯接觸和氫鍵網絡.二聚體-二聚體界面的氫鍵網絡組成主要包括: 接觸面1 由T170(A)-G199(D)形成氫鍵;接觸面2 的氫鍵網絡由K101,Q100-E224,以及K101-V225 組成.文中與結晶實驗有差別的氫鍵位于接觸面2.如圖13(a)所示,通過觀察動力學軌跡發現,接觸面2 兩側殘基間距略有增加,且K101 殘基的靈活性較大,會利用其靈活性大的特性與E224 形成鹽橋.于此同時,還與距離較近的P222 和P223 形成較弱的氫鍵.本文的結果表明,位于DNA 同側的A-D 二聚體可以形成穩定的結合界面,雖然A-D 二聚體的親和力弱于對稱二聚體,但是它介導的蛋白-蛋白相互作用是四聚體形成過程中的必要條件,它能夠促進兩個對稱二聚體的協同結合,進而形成穩定的p53 四聚體.

4 結構域之間的協同作用

早期對DNA 與p53 蛋白家族(包括p53,p63和p73)結合的比較研究表明,p53 的H1 螺旋界面二聚化對協同結合至關重要[47].為了得到二聚體中兩個單體之間的關聯作用,計算了體系中所有主鏈碳原子(共400 個)的動態互相關圖(dynamics cross correlation map,DCCM)[48].圖17 提供了在模擬過程中蛋白質殘基之間的相關運動的總體圖像,圖中的正高峰(深紅色)代表對應的兩個殘基的運動有很強的相關性,而負值(藍色)區域則代表兩個殘基向相反的方向運動(anticorrelated motion).這兩種不同的相關性,特別是結構中相距較遠的蛋白質之間的長程關聯,都與蛋白質的生物功能密切相關[49].圖中左上角和右下角的信息是完全對稱的,對角線上的兩個正方形中的信息代表單體內部的殘基間的關聯作用.而我們重點關注的是結構域之間的殘基相關性.

在不含DNA 的體系中,可以觀察到對稱二聚體的A-B 單體之間有很強的正相關性.單體A 的176—181 區域分別與單體B 的123—125,137—139,176—181,237—245 以及276—277 區域的殘基有較強的正相關性,單體A 的242—243 區域與單體B 的178—179 區域也發現了強相關性.其中A (176—181)與B (176—181)的強相關區域最大,并且與A (242—243)-B (178—179)都是參與蛋白-蛋白相互作用的區域,這與第2 節所述不含DNA 對稱二聚體系的結論一致.在與DNA 結合的對稱二聚體中,只在A (176—181)-B (176—181)和A (242—243)-B (178—179)區域有較強的正相關性.這是由于DNA 分子的支撐作用,使得A-B分子之間的相關性降低,而且,通過DNA 分子的支撐,A-B-DNA 復合分子更加穩定.這一點與RMSD 結果一致,在圖4中,A-B結合DNA后,系統表現出很強的穩定性.綜上所述,通過動態互相關網絡圖得到了對稱二聚體協同結合DNA 的直接證據,各分子單體之間有明顯的協同效應.除了參與蛋白-蛋白相互作用的區域之外,還發現了其他殘基的長程正相關性.

四聚體結構研究表明[24,50],對稱二聚體中兩個p53 單體之間的作用在很大程度上強于A-D 二聚體中兩個p53 單體之間的作用.在無DNA 結合時,A-D 二聚體由于沒有DNA 的支撐,兩單體的質心逐漸減小,變為一種生物學上不合理的結構.從動態相關圖上可以看出,即使在這種情況下,兩個p53 單體的動態相關性仍然相對很弱.結合了DNA 后的A-D 二聚體,相比對稱二聚體,A-D 二聚體中p53 單體間殘基的相關性較弱,在A (105—108,148)和D (180—184)的區間發現了較弱的正相關性.這一結論與A-D 二聚體中兩個p53 單體之間的相互作用較弱有關.

5 總結

了解蛋白質的結構和內部相互作用有多種途徑.通過X 射線單晶衍射、核磁共振、電子衍射等實驗手段可以確定蛋白質、多糖、核酸、病毒等生物大分子的晶體結構,這些結構通常是靜態的.在體外培養實驗中觀察蛋白相互作用,常常受到體外環境以及溫度的限制,而且缺乏對結構細節的描述和理解.分子動力學模擬可以在合適的力場和參數設定下計算動力學過程中晶體結構的演化,同時可以設定分子處于目標環境(如生理環境)下.因此,分子動力學模擬能夠從原子層次上提供生物大分子結構和動力學的充足信息.為了理解p53-DBD四聚體中的兩種蛋白-蛋白相互作用在四聚體形成過程中的作用,本文分別對位于DNA 對側和同側的p53 蛋白進行了分子動力學模擬,觀察在動力學穩定后蛋白-蛋白相互作用的演化,并分析DNA 在兩個模型中的重要性.應該指出,采用全原子分子動力學方法,對p53 活性四聚結構中分子間相互作用的動力學行為和穩定性進行系統的分析和討論,迄今為止未見報道.

本文的研究表明,在活性p53-DBD 四聚體中,對稱二聚體是一種穩定的結構.在與DNA 結合中,對稱二聚體主要依靠H1 短螺旋和L3 環上的殘基貢獻的非鍵相互作用,使對稱二聚體保持穩定的構象和很強的二聚親和力.此外,對稱二聚體還表現出很強的協同作用,這與對稱二聚體協同結合DNA 的實驗事實一致.位于DNA 同側的A-D 二聚體與DNA 結合時,通過L2,L5,L6 環路以及N端無序區域組成的兩個接觸面形成相互作用,并維持穩定的結合狀態.但除去DNA后,A-D 二聚體會演化成一種不合理的結構,此結構不利于p53-DBD 四聚體的形成.對DNA 的作用分析表明,DNA 在A-D 二聚體中起到了重要的骨架支撐作用.以上結果中各個p53 單體與DNA 的相互作用與實驗上的結果一致,且蛋白-DNA 間的相互作用遠強于兩種蛋白-蛋白相互作用,即與DNA 結合的二聚體受益于DNA 和二聚體的穩定接觸.本工作對p53 核心結構域的四聚體形成機制提供了見解,也表明了A-D 二聚體與DNA 的復合物是一個穩定的系統,能夠正確地反映四聚體內的相互作用.

值得指出,p53-DNA 四聚體的結構取決于它所結合的DNA 序列,p53-DBD 四聚體在DNA 上的二聚體-二聚體接觸在體內未必是固定的[24],而可能是根據不同的細胞條件適應不同的接觸.本文所研究的結構是4 個p53 亞基與DNA 一致序列結合的結構,而在一些實驗中,發現了DNA 彎曲的四聚體[25].而且,由于計算資源所限,本文僅對對稱和同側兩個二聚結構做出了分析.今后,我們還將探索不同的四聚體中蛋白-蛋白相互作用,對p53 核心四聚體全原子結構內的相互作用做出更系統的分析和討論.