母乳低聚糖與嬰幼兒健康關系研究進展

姜毅康 劉鴻飛 潘麗娜,2 胡一波 彭喜洋 康文麗 彭小雨 汪家琦 李 威 董 玲

母乳含有嬰兒生長發育所需的全部營養,通常被稱為人類生命最初幾個月營養的“黃金標準”[1]。母乳中含有大量生物活性成分,如免疫球蛋白、激素、低聚糖等,非常適合嬰幼兒尚未發育成熟的消化及免疫系統。其中母乳低聚糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在嬰幼兒消化系統及免疫調節中發揮著重要作用[2]。HMOs約占母乳中碳水化合物總量的20%[3],其含量僅次于乳糖和脂肪[4]。研究[5]表明,HMOs對嬰兒的健康成長及發育有益,例如,HMOs可作為可溶性配體類似物抑制不同病原體與細胞表面受體的結合,從而保護母乳喂養的嬰兒免受不同病原體的感染。HMOs還可作為共生細菌的益生元[3,6],維持腸道微生態平衡,調節免疫系統,以及促進嬰幼兒大腦發育等[7-8]。

文章擬綜述HMOs結構特征、生理功能的研究成果,并總結HMOs的應用現狀,以期為開發及設計新型嬰幼兒食品提供理論依據。

1 母乳低聚糖的結構及含量

目前已有超過200種HMOs的結構被確定[9-10],每個HMOs分子包含3～14個單糖,通常為直鏈或支鏈結構[1]。HMOs核心結構由5種基礎單糖組成:3種單糖,D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)和L-巖藻糖(Fuc);一種氨基糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和一種酸性單糖,N-乙酰神經氨酸(Sia)[11](如圖1)。在HMOs分子還原末端有一個乳糖殘基,乳糖通過β-1,3或β-1,6糖苷鍵連接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基乳糖延伸糖鏈;糖鏈可以由巖藻糖或唾液酸進一步修飾,從而形成HMOs結構多樣性[12-13]。一些HMOs還存在同分異構體形式,如乳酰-N-巖藻糖基五糖和唾液酸基乳酰-N-四糖[14]。根據其末端結構不同,可分為中性巖藻糖基化的HMOs、中性非巖藻糖基化的HMOs和酸性或唾液酸化的HMOs 3種類型[15]。

圖1 主要HMO的分子結構圖[8]

王艷菲等[1]通過對HMOs種類鑒定及含量測定后發現,母乳中含量較多的HMOs主要為2′-巖藻糖基乳糖(2′fucosyllactose,2′-FL)、3′-巖藻糖基乳糖(3′-fucosyllactos,3′-FL)、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose,LNT)、乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)、3′-唾液酸乳糖(3′-sialyllactose,3′-SL)和6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose,6′-SL)。為了更好貼合嬰幼兒胃腸道微生物菌群變化,HMOs含量在哺乳期內會隨著嬰幼兒的生理需求的變化而變化。早產母親成熟乳中總HMOs質量濃度為10～20 g/L,整體要高于足月分娩的母親[15]。母乳中HMOs質量濃度在整個哺乳期呈下降趨勢,初乳中HMOs質量濃度最高,為20～23 g/L,成熟乳(產后11 d～9個月母乳)中HMOs質量濃度下降至12～14 g/L[16];但Plows等[17]研究表明,母乳中2′-FL、唾液酸內酯-N-四糖b和二唾液酰基-乳糖-N-四糖的含量在哺乳過程中幾乎不發生變化;3′-FL和3′-SL在哺乳過程中的含量分別顯著增加了10倍和2倍。母乳中HMOs的類型及其平均質量濃度,具體見表1。

表1 HMOs的類型[18]

2 母乳低聚糖的功能

2.1 調節腸道菌群組成

母乳低聚糖進入人體后,可以抵抗胃酸、消化酶水解和胃腸道吸收;大部分HMOs直接進入小腸和結腸被一些微生物發酵成短鏈脂肪酸,從而形成腸道酸性環境,而腸道中的低pH環境有利于其他有益雙歧桿菌菌株的生長[18-19]。例如:HMOs通過共生細菌的選擇性消費來塑造嬰兒腸道微生物群的組成[6,20-21],其中雙歧桿菌和擬桿菌通過特定的糖苷酶消化和利用HMOs,巖藻糖基化或唾液酸基化HMOs可為代謝這些化合物的細菌提供了選擇性定殖優勢[22-24];而大多數致病性腸桿菌無法利用糖苷酶,無法將HMOs作為食物來源[19,25]。

在母乳喂養的嬰兒腸道中,雙歧桿菌豐度更大,以雙歧桿菌為主的腸道微生物群比用配方奶粉喂養的嬰兒更常見[26];而配方奶粉喂養的嬰兒腸道微生物群組成更復雜,與成人的腸道微生物群相似,以兼性厭氧菌(如擬桿菌和梭菌)為主,其次是葡萄球菌、鏈球菌和腸桿菌科[27]。De Leoz等[28]收集純母乳喂養的嬰兒第1周到第13周的糞便,糞便中HMOs含量從第1周到第13周逐漸降低,糞便中的優勢菌群從鏈球菌變化為擬桿菌和雙歧桿菌;到第13周,擬桿菌被雙歧桿菌取代,雙歧桿菌在糞便細菌群中占主導地位。研究表明,糞便中的雙歧桿菌含量與HMOs含量有明顯的負相關關系,雙歧桿菌屬能夠利用HMOs在腸道內定殖。Bondue等[29]研究表明,雙歧桿菌和粗雙歧桿菌能夠利用3′-SL進行生長,補充3′-SL的無細胞培養可以降低大腸桿菌O157:H7和傷寒沙門氏菌血清型中毒力基因的表達。

由此可見,HMOs有利于嬰幼兒腸道中益生菌的定殖和增殖,不會導致有害菌的增殖,因而可以調節嬰幼兒體內的腸道菌群的組成。

2.2 預防病原性感染

HMOs是母乳免疫成分的重要組成部分,可以保護嬰兒免受病原體的侵害。除了通過為非致病性共生菌提供競爭優勢來直接控制病原體外,HMOs還通過發揮抗黏附抗菌劑的作用來直接減少微生物感染[30-31]。大多數病原微生物,如空腸彎曲桿菌、大腸桿菌、霍亂弧菌、志賀氏菌和沙門氏菌菌株的毒力往往取決于其黏附于宿主腸道上皮表面的能力[32]。例如:Morrow等[33]關于93對母乳喂養的母嬰研究表明,2′-FL含量與空腸彎曲桿菌腹瀉及各種原因的中重度腹瀉的發生率呈顯著負相關,LDFH-I(乳糖-N-新霉素六糖)與杯狀病毒腹瀉發生率呈顯著負相關;母乳低聚糖與母嬰喂養嬰兒腹瀉之間的相關性在整個母乳喂養過程中持續存在,但在母乳喂養終止后沒有相關性,表明嬰兒胃腸道中存在的母乳低聚糖可以抑制病原體結合。

(1) 阻止致病菌的黏附和定殖。產腸毒素的大腸桿菌和尿路致病性大腸桿菌通過紅細胞識別并結合腸上皮細胞表面聚糖,唾液酸化的HMOs對產腸毒素的大腸桿菌和尿路致病性大腸桿菌介導的血凝作用有很明顯的抑制作用,從而阻止其黏附和定殖[34]。Angeloni等[35]評估了大腸桿菌在宿主腸道上皮細胞表面黏附的改變結果表明,與對照組細胞相比,經過3′-SL誘導的上皮細胞表面糖鏈的變化導致大腸桿菌黏附減少了90%。HMOs可能有糖基化作用,調節腸上皮細胞表面糖基化合物的表達,使細菌不能與表皮上特定多糖位點結合,從而抑制細菌與表皮細胞的黏附,阻止其定殖及擴散[15,36]。Manthey等[37]研究表明,腸致病性大腸桿菌(enteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)是一種腸道上皮細胞附著的病原體,可導致嚴重腹瀉,也會導致嬰兒高死亡率;從母乳中分離出的HMOs顯著減少了EPEC對上皮細胞的附著,乳鼠試驗結果也表明HMOs顯著減少了EPEC的定殖。

(2) 阻止病原體與受體結合。巖藻糖基化和/或卵球形HMOs可以捕獲病毒并參與阻斷凝集素受體,HMOs阻斷的病毒凝集素受體不能參與識別宿主細胞表面存在的糖原,從而阻止其黏附和定殖[5]。這也可以解釋為什么通過母乳喂養母嬰傳播HIV的效率低,80%～90%的嬰兒沒有感染;研究[8,38-39]表明,包膜糖蛋白gp120促進HIV與人類樹突狀細胞上的DC-SIGN(樹突狀細胞特異性ICAM3抓取非整合素)的結合,DC-SIGN通過黏膜篩選環境中潛在的病原體;雖然DC-SIGN與gp120上的高甘露糖型聚糖結合,但是其對Le血型抗原具有更高的親和力;在母乳喂養的嬰兒中,黏膜表面覆蓋著高濃度的HMOs,HMOs含有Le血型抗原,并在體外與gp120競爭結合DC-SIGN,阻斷HIV-1-gp120與DC-SIGN的結合,從而阻止HIV通過DC-SIGN進入,降低感染風險。

在大腸中,雙歧桿菌發酵HMOs后主要產物為醋酸、丁酸和丙酸,其可以降低腸道內pH值[40]。低pH值不利于致病菌的生長,因此也起到了抑菌作用[36]。此外,Kuntz等[7]研究表明,HMOs通過改變生長相關的細胞周期基因,減少細胞生長,誘導培養的人類腸上皮細胞分化和凋亡。

HMOs的抗粘連抗菌作用并不限于細菌和病毒,也適用于某些原生動物寄生蟲[41]。例如,赤痢變形蟲,它會導致阿米巴痢疾或阿米巴肝膿腫;赤痢變形蟲需要附著在宿主的結腸黏膜上,體內測定結果表明一些HMOs顯著降低赤痢變形蟲的附著[42]。這些研究結果都表明,HMOs具有調節病原體—宿主相互作用的能力。

2.3 免疫調節作用

新生兒免疫系統尚未發育完全,母乳喂養可以幫助嬰幼兒增強抵抗力[43],降低疾病感染的概率,而HMOs在其中發揮著重要作用。

HMOs能通過調節腸道菌群的構成或刺激腸上皮細胞的免疫反應,從而保護宿主免受病毒感染[14]。研究表明HMOs可在局部黏膜相關淋巴組織的細胞中發揮作用,刺激機體產生免疫物質,從而提高機體免疫能力,1%的HMOs被吸收后可以到達全身循環[44]。Liu等[45]研究HMOs對β-Lg誘導牛奶過敏的小鼠模型的免疫調節結果表明,2′-FL降低了血清IgE和β-Lg特異水平IgE,并顯著增加了抗炎細胞因子IL-10、TGF-β和IFN-γ的水平,可以緩解過敏癥狀。Eiwegger等[46]報道,唾液酸化的HMOs可刺激T細胞成熟,促進T細胞反應轉化為更平衡的Th1/Th2細胞因子的產生和低水平的免疫;一些唾液酸化的HMOs對預防過敏可能有一定的作用。

某些巖藻糖基化的HMOs,可激發巨噬細胞活性,促進其分泌免疫物質[47]。Sprenger等[48]發現,與對照組相比,喂食含2′-FL及LNnT奶粉的嬰兒一年內患下呼吸道疾病的次數更少,對抗生素的需求也更低。與配方奶粉喂養的嬰兒相比,HMOs有助于降低母乳喂養嬰兒上呼吸道和泌尿感染的發生率[8]。無乳鏈球菌(group BStreptococcus,GBS)會導致新生兒敗血癥和腦膜炎[49],多人研究[50-52]表明,HMOs對無乳鏈球菌(group BStreptococcus,GBS)有明顯的抗菌活性,而不依賴于宿主免疫。

2.4 預防壞死性小腸結腸炎

HMOs有助于降低炎性疾病的發生率,如壞死性小腸結腸炎(necrotising enterocolitis,NEC)。NEC是早產兒最常見和最具破壞性的腸道疾病之一,其原因主要為腸道屏障受損、免疫不成熟和腸道微生物失調[53]。新生兒科的進步提高了早產嬰兒和低出生體重嬰兒的存活率,也導致越來越多的嬰兒面臨NEC風險[54]。早產低體重嬰兒的NEC發生率為5%～10%[14],死亡率超過25%,即使通過醫學手段治愈,存活者也會面臨長期的神經并發癥[5]。研究[55]表明,NEC發病率在配方奶喂養的嬰兒中是母乳喂養嬰兒的6～10倍。

Huang等[56]研究表明,3′-SL和6′-SL通過抑制TLR4/NF-κB通路的激活,可以有效緩解NEC缺氧誘導的損傷。Autran等[57]從體外組織培養、動物模型體內研究及母嬰隊列研究的數據分析得出,HMOs在預防NEC的發生上起著重要作用。Autran等[58]以患有NEC的小鼠為對象研究表明,喂養含HMOs配方奶小鼠的存活率顯著高于喂養含低聚半乳糖配方奶的小鼠,HMOs可有效降低患上NEC的風險。Sodhi等[59]研究表明,2′-FL和6′-SL這兩種HMOs可以與TLR4的LPS結合位點相互作用(如圖2所示),在小鼠和仔豬模型中預防NEC。

圖2 2′-FL、6′-SL及乳糖(LAT)與TLR4-MD2復合物對接[59]

2.5 促進大腦發育

嬰兒大腦的快速發育對飲食營養的供給提出了特別高的要求,尤其是對早產兒。唾液酸(sia)是腦神經節苷脂和聚唾液酸鏈的組成成分,其中聚唾液酸鏈對神經細胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM) 起到修飾作用;NCAM在細胞間的相互作用、神經元生長、修改突觸連接和記憶形成中發揮重要作用[60]。研究[61]表明,在仔豬飼料中添加唾液酸可以影響NCAM的基因表達,并提高學習和記憶能力。唾液酸化的HMOs是母乳中唾液酸的主要來源,因此唾液酸化的HMOs在促進嬰兒大腦發育方面發揮著重要作用;巖藻糖基化的HMOs(如2′-FL)對嬰兒的大腦發育也表現出積極的影響[62]。Oliveros等[63]給哺乳期大鼠幼鼠口服2′-FL,并在其4～6周齡及1歲時進行經典行為測試,結果表明,盡管兩組動物在剛斷奶時表現出相似的行為,但口服2′-FL的大鼠在1歲及成年后均表現出更強的認知能力,說明哺乳期補充2′-FL可增加兒童及成年期的認知能力。Berger等[64]研究發現在嬰兒1個月大時,母乳喂養的頻率越高,嬰兒的認知能力就越強,這是由于其攝取了更多的2′-FL;但在嬰兒6個月大時開始母乳喂養,并未觀察到類似的相關性,表明早期接觸2′-FL可能對提高嬰兒的學習和記憶更為重要,而且這種益處可能會持續到成年。HMOs還可以促進代謝產物的產生,從而支持嬰兒的認知發育。在體外試驗中,2′-FL增加了腸道擬桿菌和乳酸菌的豐度,從而增加了短鏈脂肪酸的產生,而短鏈脂肪酸是大腦信號傳遞的底物[19]。

3 母乳低聚糖的開發與應用

HMOs對嬰兒的益處已經得到了廣泛驗證,因此如何開發利用HMOs成為當下研究熱點。到目前為止,只要少數短鏈HMOs可用,需要提供更復雜和支鏈的HMO。通過離心、沉淀、分級提取和各種色譜方法從母乳中提取HMOs既耗費時間也存在倫理問題,低聚糖作為商業食品添加劑[65],以母乳為原料幾乎可以排除在外。目前,HMOs主要通過化學合成法、酶促合成法、化學酶合成法、微生物發酵法[66]。

(1) 化學合成法。可以合成四糖～八糖等15種不同結構的HMOs,巖藻糖基化產生了巖藻糖乳糖和二巖藻糖醛酸、LNnT和LNT、LNFP I或LNFP III,化學唾液酸化也產生了一些唾液酸化的HMO。通過化學合成生產HMOs的成本高,產量低(20%～55%)。

(2) 酶促合成法。糖基轉移酶(GTs)和糖苷水解酶(GHs)兩類酶被用于合成低聚糖,可以制備20多種HMOs,包括2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、3′-SL、6′-SL、DSLNnT等。這種方法可以比化學方法獲得結構更復雜的HMOs,合成的效率也相對較高;但是通過酶促方法獲得的HMO結構的多樣性會受到底物特異性和糖苷酶可用性的限制。

(3) 化學酶合成法。在這種方法中,使用所需底物的化學合成,然后進行酶促延伸和修飾;可以合成3-FL、LNT、LNT II、具有或不具有巖藻糖基化和/或唾液酸化的雙天線和不對稱多天線HMOs等,可以實現毫克級的制備。

(4) 微生物發酵法。可在合適的重組微生物宿主生物中建立生物合成體系。盡管沒有原核微生物能天然產生HMOs,但也可以由現有的代謝途徑提供,例如非致病性大腸桿菌菌株等宿主生物體中;通過重組細菌細胞的全細胞生物轉化可以制備2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、LNFP I、3′-SL和6′-SL等HMOs[67]。當前已實現工業化生產的HMOs有2′-FL、3′-FL、LNT、LNnT、3′-SL、6′-SL等[55]。

當前歐盟已經批準2′-FL、LNnT、LNT、3′-SL和6′-SL應用到嬰幼兒配方食品中,美國、新加坡及澳新已允許在嬰幼兒配方食品中添加2′-FL和LNnT,韓國、菲律賓及馬來西亞也已批準在嬰幼兒配方食品中添加2′-FL。且部分國外公司已經推出含有HMOs的嬰幼兒配方奶粉。對于不能母乳喂養的嬰兒,HMOs的有益特性讓添加HMOs的嬰幼兒配方奶粉成為一個極具吸引力的選擇。Marriage等[68]通過臨床試驗發現,嬰兒在喂養含有0.2 g/L及1 g/L 2′-FL的嬰幼兒配方奶粉4個月后,其生長發育情況和母乳喂養嬰兒無顯著差距。Puccio等[69]針對6個月大嬰兒的研究表明,含有2′-FL(1 g/L)和LNnT(0.5 g/L)的嬰兒配方是安全且耐受良好的,與喂養不含有HMO成分的配方奶粉的對照組相比支氣管炎和下呼吸道發病率降低。因此,含HMOs的嬰幼兒配方奶粉不僅支持免疫和食道健康,在成分和功能上也更接近于母乳。

4 總結與展望

母乳低聚糖(HMOs)作為母乳中一類活性成分,對嬰幼兒的健康成長有著至關重要的作用,關于HMOs的研究也取得了長足的進步。然而,許多關于HMOs代謝和健康益處、生物合成的問題仍未得到解答,以及確認觀察到的效果能否轉化為新生兒可衡量的健康益處仍需要深入研究。未來關于HMOs如何在人類乳腺中合成及其對母乳喂養嬰兒的有益影響的深入研究十分必要,有助于開發新的策略和技術來生成和應用復雜的HMOs混合物,進一步指導如何將HMOs作為嬰兒配方奶粉的補充劑。

鑒于母乳低聚糖的工業化生產,全細胞生物轉化是現階段提供母乳低聚糖作為食品添加劑的最有前途的選擇,其合成的效率和產率仍需要提高,以滿足未來食品工業食品添加劑的需求。隨著對細胞培養肉的日益關注,利用哺乳動物細胞培養法合成HMOs也引起了行業的關注;未來,內源性HMOs生物合成的策略和獲得HMOs的所有其他方法將被系統的考慮,以提供應對當前挑戰的解決方案。

由于受環境、基因、個體差異的影響,母乳中HMOs的分布與含量差異很大。未來有必要建立中國HMOs數據庫,根據中國母乳實際情況制定適合的添加量及配比,為中國嬰幼兒量身打造精確化的乳粉營養配方,開發更適合中國嬰幼兒成長發育的功能健康食品。