豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶（ApCDAs）的鑒定及表達特性

陶妍 李春春 張克信 孔利利 劉長仲

摘 要 通過BLAST比對和軟件分析，共篩選出4個豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）幾丁質(zhì)脫乙酰基因 ?（ ?ApCDA1、 ?ApCDA2、 ?ApCDA3和 ?ApCDA5），并分析了其生物學(xué)信息；通過實時熒光定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)4個ApCDAs在各發(fā)育階段均有表達，其中， ?ApCDA1基因在1齡、2齡若蟲和成蟲期表達量較高； ?ApCDA2基因在4齡若蟲的表達量高于其他齡期； ?ApCDA3基因在各發(fā)育階段后期的表達量顯著高于前期和中期，2齡若蟲后期表達量最高； ?ApCDA5基因在3齡若蟲的表達量偏高，2齡后期的表達量最高；此外， ?ApCDA1和 ?ApCDA3在3齡若蟲和成蟲中腸、胚胎和表皮內(nèi)的表達量均顯著高于 ?ApCDA2和 ?ApCDA5。結(jié)果表明，ApCDAs基因?qū)ν愣寡恋纳L發(fā)育和蛻皮具有重要作用。

關(guān)鍵詞 豌豆蚜；幾丁質(zhì)脫乙酰酶；表達模式；RT-qPCR

豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，屬蚜科（Aphididae）無網(wǎng)管蚜屬（Acyrthosiphon），為害香豌豆、蠶豆、苜蓿、草木犀、大豆等草本豆科植物[1]。另外，豌豆蚜還可以傳播苜蓿花葉病毒和豌豆耳突花葉病毒等多種植物病毒[2]，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大損失。長期以來，蚜蟲的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而，大面積使用化學(xué)農(nóng)藥，致使大量天敵被殺，3R問題日漸嚴重[3-4]，生物農(nóng)藥具有低毒、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等特點，為蚜蟲治理的首選殺蟲劑。目前，豌豆蚜作為模式蚜蟲其基因組測序已完成[5]，為豌豆蚜的生物防治和進一步的分子試驗奠定了基礎(chǔ)。

幾丁質(zhì)（Chitin）又稱甲殼素、殼多糖[6]，主要存在于昆蟲的表皮、中腸、圍食膜、體壁和氣管上皮中，在昆蟲的生長發(fā)育過程中，保護其免受病原物等的侵害[7-8]。幾丁質(zhì)對昆蟲而言，不僅有支撐、保護和抵御環(huán)境壓力的作用[9]，也與昆蟲的蛻皮及翅的形成密切相關(guān)[10]。研究表明，在褐飛虱中幾丁質(zhì)含量越少，脫皮越困難，翅的表型越畸形[10]。在昆蟲中，幾丁質(zhì)傳統(tǒng)上被認為是表皮、氣管和營養(yǎng)基質(zhì)的中心成分。然而，最近一些研究報道，與幾丁質(zhì)相關(guān)的基因在幾種昆蟲物種的卵巢、卵和蛋殼中表達[11-13]。因此在生物防治中，幾丁質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶成為了潛在的綠色農(nóng)藥 ?靶標。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶（Chitin deacetylase，CDA） 是幾丁質(zhì)降解酶系成員之一，能夠催化幾丁質(zhì)水解，轉(zhuǎn)化為殼聚糖[14-15]。幾丁質(zhì)脫乙酰酶（CDA）的主要作用底物有幾丁質(zhì)、殼聚糖、殼寡糖等[16] 。由于CDA的來源不同， 其酶學(xué)性質(zhì)也存在差異性。到目前為止， 自然界所發(fā)現(xiàn)的CDA都是糖蛋白。2005年，Guo等[17]首次從粉紋夜蛾[Trichoplusia ni （Hübner）]中篩選得到幾丁質(zhì)脫乙酰酶（TnPM-P42），并發(fā)現(xiàn)該蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合緊密。研究發(fā)現(xiàn)，黃野螟（Heortia vitessoides）、粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和赤擬古盜（Tribolium castaneum）等在表皮的形成過程中均受到CDAs的影響[17-20]，且? ?CDA3在亞洲柑橘木虱的3齡若蟲和表皮中高表達[21]，? ?CDA5在暗黑鰓金龜幼蟲中高表達。目前，幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究已經(jīng)應(yīng)用于多種昆蟲[18-24]，其中包括豌豆蚜。

幾丁質(zhì)脫乙酰酶通過控制幾丁質(zhì)的代謝，進而控制其生長機制，是生物防治的作用靶標。本研究篩選ApCDAs基因，分析ApCDAs基因的基本信息，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）方法分析ApCDAs基因在不同發(fā)育階段及不同組織中的表達模式，為進一步探究ApCDAs的生理功能奠定了理論基礎(chǔ)，為豌豆蚜的生物防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

植物材料：蠶豆品種‘臨蠶6號購買于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蠶豆種子種植到帶土（土壤∶草炭∶蛭石=3∶2∶1）的塑料花盆（直徑9 cm，每盆育苗4株）中。盆栽蠶豆在無蟲的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度20 ℃±1? ℃，相對濕度70%±10%，光暗周期為 16 h L∶8 h D。選取生長發(fā)育一致的蠶豆葉片用于試驗。

供試蟲源及飼養(yǎng)條件：豌豆蚜采集于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實驗室，多代培養(yǎng)。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度20 ℃±1 ℃，相對濕度70%±10%，光暗周期為 16h L∶ 8h D（未接觸任何殺蟲劑），采用蠶豆葉片飼養(yǎng)。

1.2 序列比對及分析

在豌豆蚜數(shù)據(jù)庫中下載豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的數(shù)據(jù)信息，通過NCBI網(wǎng)站上的BLAST在線程序進行基因的搜索及比對，下載豌豆蚜及其他昆蟲的CDA基因，在SMART （https：∥smart.embl.de） 網(wǎng)站中進行豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域進行分析；使用在線網(wǎng)站 ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測氨基酸的等電點和分子質(zhì)量，以DNAMAN 8和MEGA 7進行序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的 ?建立。

1.3 樣品的準備

取生長狀況良好的成蚜在放有蠶豆葉片的培養(yǎng)皿中進行繁殖，每個培養(yǎng)皿中放入10頭成蚜，產(chǎn)蚜3 h后移去成蚜，收取不同齡期若蚜的前期、中期和后期樣品，以及成蚜產(chǎn)蚜前和產(chǎn)蚜后樣品；并對3齡若蚜和成蚜進行解剖收樣，收取其中腸、胚胎和表皮。將所收取的樣品迅速放入液氮中冷凍，并置于-80 ℃冰箱，備用。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

將-80 ℃冰箱中的樣品取出，采用TRIzol法（Invitrogen，TRIzolReagent）提取豌豆蚜樣品的RNA，使用微量分光光度計對提取到的RNA進行濃度及純度檢測，合格的置于-80 ℃冰箱，備用。取1 μg質(zhì)檢合格的RNA，使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取到的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA的第1條鏈，具體方法參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱，備用。

1.5 引物的設(shè)計及RT-qPCR反應(yīng)

根據(jù)基因序列信息，使用Primer Premier 6設(shè)計基因的引物，并在NCBI網(wǎng)站進行比對，以確保該引物只對該基因一處位點起作用（如表1），通過查閱文獻確定內(nèi)參基因[25]。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，使用表1 中的引物序列和TIANGEN試劑盒進行實時熒光定量PCR測定。利用2－△△CT方法對豌豆蚜不同發(fā)育階段和3齡若蟲及成蟲不同組織的幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的表達量進行分析[26]。使用Microsoft Excel 2021和SPSS 26.0軟件統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析法（ANOVA）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蚜CDA蛋白質(zhì)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過在NCBI網(wǎng)站上的BLAST在線程序進行基因的搜索及比對，共得到4個ApCDAs基因（表2），4個豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因所編碼的氨基酸長度為479～998 bp，蛋白分子質(zhì)量為 ?54.49～112.65 ku，理論等電點為5.12～7.23。

豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖1），蛋白質(zhì)ApCDA1、 ApCDA2、 ApCDA3和ApCDA5均有1個信號肽在起始位點處，且均有1個幾丁質(zhì)脫乙酰酶結(jié)合域，ApCDA1、 ApCDA3和ApCDA5具有幾丁質(zhì)脫乙酰酶催化域，僅有ApCDA1和ApCDA2具有低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域，ApCDA5具有6處低復(fù)雜度區(qū)域。

將豌豆蚜與其他昆蟲的CDA進行比對，基于鄰位歸并法（NJ）和Kimura-2參數(shù)模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。豌豆蚜的 ??CDA1基因與普通草蛉（Chrysoperla carnea）、煙草甲（Lasioderma serricorne）及白魔按蚊（Anopheles albimanus）的 ??CDA1基因聚在一起，美國白蛾（Hyphantria cunea）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和云杉色卷蛾（Choristoneura fumiferana）的 ??CDA2聚在一起，稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）和黃野螟（Heortia vitessoides）的 ??CDA2聚在一起，赤擬古盜（Tribolium castaneum）、中華盜蝗（Oxya chinensis）和東亞飛蝗（Locusta migratoria）的 ??CDA2聚在一起，這些昆蟲又與豌豆蚜的 ??CDA2基因聚在一起，豌豆蚜的? ?CDA3與白背飛虱（Sogatella furcifera）和褐飛虱（Nilaparvata lugens）的? ?CDA3聚在一起，? ?CDA5與赤擬古盜和黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的? ?CDA5聚在一起，表明所篩選基為豌豆蚜CDA基因，豌豆蚜 ??CDA2基因與其他昆蟲的 ??CDA2基因親緣關(guān)系較遠，且通過系統(tǒng)發(fā)育樹證明豌豆蚜CDA基因與白背飛虱及褐飛虱的CDA基因親緣關(guān)系 ?較近。[FL）]

2.2 豌豆蚜CDA基因的時空表達

2.2.1 不同齡期的表達模式 通過實時熒光定量PCR檢測幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因在不同發(fā)育階段（1齡、2齡、3齡、4齡若蚜和成蚜）的不同時期（前期、中期和后期）的特異性表達模式，ApCDAs基因在所收集的所有豌豆蚜樣本中均有表達（圖3），表明ApCDAs在均參與了豌豆蚜的幾丁質(zhì)代謝過程。所有4個ApCDAs在3齡和4齡均在中期的表達量最低； ?ApCDA3、 ?ApCDA5在1齡和2齡前中后的表達量逐漸升高；除了 ?ApCDA3外，其余3個ApCDAs在成蟲產(chǎn)蚜后的表達量均高于產(chǎn)蚜前。

ApCDA1在2齡中期的表達量最高，且顯著高于后期（P<0.05），后期的表達量又顯著高于前期（P<0.05）；在4齡前中后其的表達量均低于其他齡期；在1齡后期的表達量顯著高于中期（P<0.05），中期的表達量又顯著高于前期（P<0.05）；成蚜的表達量明顯高于其他ApCDAs（圖3-A）。

ApCDA2在各個齡期的表達（圖3-B）有所不同，在4齡若蟲的前、中、后期表達量均最高，成蚜的表達量最低，且明顯低于其他ApCDAs；與其他齡期不同，1齡若蟲在中期的表達量最高，前期的表達量最低；2齡若蟲后期的表達量顯著高于中期（P<0.05），中期的表達量又顯著高于前期（P<0.05）。

ApCDA3在2齡若蟲后期的表達量最高，且3齡、4齡若蟲和成蟲的表達量無明顯差異；3齡和4齡若蚜后期的表達量顯著高于中期（P< ?0.05），且前期與中期及后期的表達量差異顯著（圖3-C）。

ApCDA5在2齡后期表達量最高，成蚜的表達量最低；3齡若蚜前中后期表達量無顯著差異，3齡和4齡若蟲在前期的表達量最高，中期的表達量最低（圖3-D）。

2.2.2 不同組織的表達模式 通過實時熒光定量PCR檢測ApCDAs基因在不同組織中的表達模式，結(jié)果表明，ApCDAs基因在豌豆蚜的中腸、胚胎及表皮中均有表達，但表達水平存在差異（圖4）。 ?ApCDA1和 ?ApCDA3在3齡若蟲和成蟲的中腸、胚胎以及表皮的表達量均高于 ?ApCDA2和 ?ApCDA5，且 ?ApCDA5在3齡若蟲和成蟲中的表達量均最低。在3齡若蟲中，ApCDAs在表皮中的表達量均顯著高于中腸和胚胎（P<0.05），且每個基因在胚胎和表皮中的表達無顯著差異。

不同ApCDAs在成蟲不同組織的表達模式顯示， ?ApCDA1在胚胎的表達量顯著高于表皮 ?（P<0.05），在表皮的表達量又顯著高于中腸 ?（P<0.05）； ?ApCDA2和 ?ApCDA3在胚胎和表皮的表達量顯著高于中腸（P<0.05），且 ?ApCDA3在中腸、胚胎及表皮的表達量均高于其他基因，胚胎和表皮無顯著差異，但胚胎的表達量略高于表皮； ?ApCDA5在表皮的表達量顯著高于中腸和胚胎（P<0.05），中腸與胚胎間的表達量無顯著差異，且該基因在中腸、胚胎和表皮的表達量 ?極低。

3 討? 論

幾丁質(zhì)是昆蟲外骨骼的主要組成成分，在生長發(fā)育過程中作用重大[8]。幾丁質(zhì)脫乙酰酶是幾丁質(zhì)代謝過程中的重要酶類之一[27]，在生物防治中，已經(jīng)被證明其為殺蟲劑的潛在靶標[22]，可通過抑制該酶有效控制害蟲[23]。豌豆蚜為害范圍廣[5]，造成的經(jīng)濟損失嚴重，可通過抑制該酶有效控制豌豆蚜。本試驗通過ApCDA基因的搜索和BLAST比對篩選了4個豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因，分別為? ?ApCDA1、 ?ApCDA2、 ?ApCDA3和 ?ApCDA5，分析發(fā)現(xiàn)該基因的氨基酸序列與昆蟲脫乙酰酶的氨基酸序列相符，表明篩選得到的氨基酸序列為豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶序列。系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)， ?ApCDA3與白背飛虱和褐飛虱的CDA親緣關(guān)系較近。作為調(diào)控蚜蟲代謝的重要基因之一，研究該基因的功能，既可了解豌豆蚜的發(fā)育，又可評估其在害蟲防治中的用途。

因此，本試驗主要對ApCDAs的時空表達進行研究，分析其在豌豆蚜不同發(fā)育時期及不同組織內(nèi)的表達模式。通過實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)，4個ApCDAs基因在豌豆蚜每一個發(fā)育階段及組織內(nèi)均有表達，且具有不同的表達特點。 ?ApCDA1和 ?ApCDA2基因與黃野螟幾丁質(zhì)脫乙酰酶 ??CDA1和 ??CDA2基因的表達相似[18]，在成蟲和3齡若蟲的中腸表達量均最低，3齡若蟲的表皮表達量最高，且在蛻皮前（后期）表達量上升， ?ApCDA1和 ?ApCDA2基因與表皮的形成有關(guān)，在成蟲胚胎的表達量最高，因為豌豆蚜需在成蟲期進行產(chǎn)蚜，胚胎比若蟲期更為發(fā)達，表達量最高。亞洲柑橘木虱? ?CDA3基因在表皮表達量最高，中腸表達量最低[21]，與 ?ApCDA3基因在3齡若蚜表達量一致，成蟲在胚胎表達量高于表皮，原因與 ?ApCDA1和 ?ApCDA2基因一致，亞洲柑橘木虱共有包括卵在內(nèi)的6個發(fā)育階段，在3齡若蟲的表達量最高，而豌豆蚜與其發(fā)育歷期不同，所以最高表達量出現(xiàn)在2齡后期。暗黑鰓金龜幼蟲和赤擬谷盜的? ?CDA5基因在中腸的表達量最高[20，22，24]，稻縱卷葉螟的? ?CDA5基因參與蛻皮，在表皮中的表達量最高，朱砂葉螨的? ?CDA5在卵期的表達量最高[28]， ?ApCDA5基因在3齡穩(wěn)定表達，且表達量較高，3齡若蟲和成蟲與稻縱卷葉螟一致，均在表皮表達量最高。

總之，本試驗通過RT-qPCR檢測，證明ApCDAs基因在豌豆蚜不同發(fā)育階段和組織中均有表達，表達量上有相似性，但又存在許多差異。CDA基因已被證明是殺蟲劑的潛在靶標，本試驗結(jié)果補充了ApCDAs基因家族的數(shù)據(jù)，為基于靶向殺蟲基因的篩選奠定基礎(chǔ)，并為ApCDAs蛋白為靶標的豌豆蚜生物防治提供了理論支撐。

4 結(jié) 論

篩選了豌豆蚜幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因（ ?ApCDA1、 ?ApCDA2、 ?ApCDA3和 ?ApCDA5），并獲得其cDNA的全長序列；分析了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，建立了與其相關(guān)的系統(tǒng)發(fā)育樹；通過RT-qPCR測定了不同發(fā)育階段及不同組織的表達量，推測ApCDAs基因參與了豌豆蚜蛻皮和新表皮的形成過程。

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Identification and? Expression of Aphid Chitin Deacetylases （ApCDAs） in Acyrthosiphon pisum

Abstract

Through BLAST and software analysis，we identified four chitin deacetylation genes （ ?ApCDA1， ?ApCDA2， ?ApCDA3? and? ?ApCDA5） in Acyrthosiphon pisum，and analyzed their biological characteristics.Real-time PCR indicated that all four ApCDAs were expressed at? developmental stages.? ?ApCDA1? exhibited higher expression in first instar nymphs，second instar nymphs and adults，while? ?ApCDA2 displayed higher expression in the fourth instar nymphs compared to other instars.The expression of? ?ApCDA3 was significantly higher at the late stage of development than at the early and middle stages，with peak expression occurring? at the late stage of the second instar nymphs.Furthermore，the expressions of? ?ApCDA1 and? ?ApCDA3 were significantly higher than those of? ?ApCDA2 and? ?ApCDA5 in the midgut，embryo and epidermis of third instar nymphs and adults.In summary，ApCDAs play a key role in the growth and development of pea aphid.

Key words Acyrthosiphon pisum; Chitin deacetylase; Expression pattern; RT-qPCR