西北地區草地貪夜蛾種群遺傳多樣性分析及治理策略

張大為 陳靖 魏玉紅 惠娜娜 郭致杰 羅進倉

摘 要 旨在明確甘肅省草地貪夜蛾的入侵來源，并制定科學有效的防控對策。基于mtCOI基因分子標記分析中國草地貪夜蛾不同生態區8個省12個地理種群276個樣品的遺傳多樣性指數、遺傳分化系數及基因流等。結果表明，甘肅省草地貪夜蛾種群的單倍型多樣性指數和平均核苷酸差異數分別為0.133～0.157與0.133～0.317，均低于中國周年繁殖區廣東、廣西、云南種群的0.157～0.819與1.033～7.705；所有種群的Tajimas D中性檢驗和Fus F檢驗結果均為負值，表明草地貪夜蛾入侵中國后經歷了明顯的種群擴張事件。四川種群與其他種群遺傳分化顯著，62個種群間存在中等程度以上的基因交流。陜西略陽、陜西寧強、甘肅徽縣、甘肅成縣種群的有效遷入個體數和有效遷出個體數之和分別為11 860.66、11 708.65、10 878.66和10 379.32，在中國草地貪夜蛾的基因交流過程中具有中繼站的作用，表明陜南漢水谷地為中國草地貪夜蛾西線北遷入侵西北的主要通道。

關鍵詞 mtCOI基因；草地貪夜蛾；遺傳多樣性；遺傳分化；基因流

草地貪夜蛾[Spodoptera frugiperda（J.E.Smith）]是原產于美洲熱帶和亞熱帶地區的重大農業遷飛性害蟲[1-2]。在美洲適生寄主多達350余種，但主要嗜食玉米、高粱、甘蔗等C4作物[3-4]，可導致玉米減產70%以上[5]。強大的適應能力及飛行能力使其在侵入非洲后短期內席卷撒哈拉以南的44個國家[6]，2018年侵入印度后聯合國糧農組織對草地貪夜蛾作出了全球預警，但其仍快速擴散至整個亞洲及大洋洲[7]。2019年草地貪夜蛾經緬甸入侵中國后迅速在26個省（區）發生危害[8-9]，并在南方地區完成了定殖。鑒于其為害嚴重性，農業農村部將其列為中國“一類農作物病蟲害”之首[10]，草地貪夜蛾北遷日期的提前、蟲源基數的逐年增加將對中國糧食安全構成持續的嚴峻威脅[11-13]。

甘肅地域狹長，是連接中國西北和西南地區的戰略要道。隴南地區地處青藏高原東麓，橫斷山脈和秦嶺的交匯處，是草地貪夜蛾隨夏季東南季風進入中國西北地區橋頭堡和重要的“中轉補給站”[13]。甘肅省區域特色作物玉米、小麥、雜糧、馬鈴薯[14]等均是草地貪夜蛾的嗜食寄主，其中，全省玉米種植面積連年穩定在100萬hm2以上[15]，河西走廊制種玉米產量占全國一半以上。研究顯示入侵中國的草地貪夜蛾以“玉米型”為主[16]，因此，遏制草地貪夜蛾經隴南地區進一步向西北擴散對于保障中國的糧食安全具有重要 ?意義。

根據草地貪夜蛾的發生規律及為害特點，中國劃定了周年繁殖區，遷飛過渡區和重點防范區實施分區治理策略[17]。區域性和暴發性的為害特點使得化學防治成為控制草地貪夜蛾最主要的手段[18]，不同區劃的害蟲治理策略存在差異，進而草地貪夜蛾對藥劑的敏感程度也不盡相同。因此，明確入侵中國西北地區草地貪夜蛾的入侵來源及潛在的擴散路徑對于該蟲的科學治理具有重要的指導作用。線粒體DNA是分析昆蟲種群遺傳結構的常用分子標記之一，其細胞色素氧化酶I亞基（mtCOI）基因相對保守且多態性好，已被廣泛用于多種外來入侵昆蟲的物種鑒定[19-21]、種群遺傳分化[22-25]、基因流[26-28]及系統發育[20，29]等方面的研究。國內有學者研究了草地貪夜蛾入侵初期中國周年繁殖區不同種群的遺傳多樣性[30-31]，但定殖中國后西北地區的草地貪夜蛾種群遺傳多樣性研究未見報道。因此，本研究采集中國草地貪夜蛾周年繁殖區（海南省、廣西省、廣東省、云南省）、遷飛過渡區（四川省、陜西省、湖北省）及重點防范區（甘肅省）的12個地理種群共276個樣本，基于mtCOI分子標記技術分析不同地理種群的遺傳多樣性指數、遺傳分化系數及基因流，以期揭示草地貪夜蛾定殖中國后不同地理種群遺傳結構變化，分析入侵西北地區草地貪夜蛾的可能蟲源地及擴散路徑，為制定科學有效的防控對策提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2021年5-7月在中國草地貪夜蛾周年繁殖區海南省、廣東省、廣西省、云南省，遷飛過渡區湖北省、陜西省、四川省和重點防范區甘肅省采集12個草地貪夜蛾種群共276個樣本，具體采集點位信息見表1。各采樣點選取草地貪夜蛾發生為害的典型地塊，采用對角線五點取樣法在玉米喇叭口期采集3～5齡幼蟲，所有幼蟲樣本浸泡于95%的無水酒精，帶回實驗室后-20 ℃保存，備用。[FL）]

1.2 儀器和試劑

移液器，德國Eppendorf 公司；PCR儀，杭州博日科技有限公司，型號為XPcycle；水平電泳槽，北京君意東方電泳設備有限公司，JY-SPCT；臺式高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司，Allegra 21R；全自動數碼凝膠圖像分析系統，上海天能科技，Tanon-1600；電子天平，美國 AHOMS 公司，AR5120；DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司，DP304；2×Taq PCR MasterMix，南京諾唯贊生物技術有限公司；AL2000 DNA Marker（2 000 bp），南京鐘鼎生物技術有限公司，DM0101；離心管，美國Axygen公司，311-01-051；滅菌槍頭，美國Axygen公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 草地貪夜蛾基因組DNA的提取

參照DNA提取試劑盒說明書提取單頭草地貪夜蛾幼蟲樣本的基因組DNA，提取后的DNA以20? μL的超純水稀釋至200? ng/μL，-20 ℃保存，備用。

1.4 草地貪夜蛾mtCOI基因序列的擴增

根據NCBI已公布的草地貪夜蛾線粒體DNA全長序列（GenBank登錄號：KM362176.1），參考李向永等[31]設計的草地貪夜蛾mtCOI特異性引物，選取FAW-F：5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′和FAW-R：5′-CCATTACATATAATCTGCCATATTA-3′用于基因擴增，引物由南京集思慧遠生物科技有限公司合成。

PCR反應體系（20 μL）：2×Taq PCR MasterMix，10 μL；正向引物（10 μmol/L），1 μL；反向引物（10 μmol/L），1 μL；模板DNA，1 μL；ddH2O，7 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環32次；最后72 ℃再延伸5 min。擴增結束后取20 μL擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳分離30 min，經凝膠成像系統分析后拍照保存。

1.5 數據分析

所有樣品的PCR產物回收純化后，委托南京集思慧遠生物科技有限公司進行雙向測序。使用Mafft軟件（V7.427）對一代測序序列進行質量檢測及多序列比對；采用DnaSP 6.0（V6）軟件計算草地貪夜蛾12個地理種群的多態位點數、單倍型多樣性、核苷酸多樣性、Tajimas D中性檢驗和Fus F檢驗等；采用Arlequin（V3.5.2.2）計算12個草地貪夜蛾種群的遺傳分化系數Fst，并根據Nm=（1-Fst）/2Fst公式計算種群間的基因流Nm；采用Migrate（V3.7.2）軟件計算12個草地貪夜蛾種群的有效遷入數及遷出數。

2 結果與分析

2.1 草地貪夜蛾不同地理種群的遺傳多樣性 ?指數

完成了對草地貪夜蛾12個地理種群276個樣本的DNA提取，所有樣本DNA帶型一致，純度好且無降解現象發生，符合mtCOI分子標記測序的要求。經Mafft軟件對DNA序列進行多序列比對后，供試的276個草地貪夜蛾樣品共獲得243個mtCOI基因序列，所有mtCOI基因序列均無插入或缺失，根據比對結果選取782 bp長度進行后續分析。

在12個草地貪夜蛾地理種群中，變異的多態性位點為27，單倍型多樣性為0.273，核苷酸多樣性為0.436，平均核苷酸差異數為3.184，種群間Tajimas D值為-2.567 3，（P< ?0.001），Fus F值為-8.262 3，（P<0.01），差異極顯著，表明草地貪夜蛾定殖中國后發生了全面、快速的種群擴張。周年繁殖區GD、GX和YN種群的單倍型多樣性為0.157～0.819，核苷酸多樣性為 ?0.137～1.041，平均核苷酸差異數為1.033～ ?7.705；遷飛過渡區SC、HB、LY和NQ種群的單倍型多樣性為0.080～0.672，核苷酸多樣性為 ?0.021～? 1.646，平均核苷酸差異數為0.160～ ?12.336；甘肅省CX和HX種群的單倍型多樣性為0.133～ ?0.157，核苷酸多樣性為0.017～ ?0.041，平均核苷酸差異數為0.133～0.317。GD種群的單倍型多樣性和核酸多樣性最高，最低為甘肅的HX種群（表2）。

中性檢驗顯示，中國周年繁殖區GD、GX和YN種群的Tajimas D值為-2.293 2～ ?-0.170 8，Fus F值為-3.580 8～-0.305 5；遷飛過渡區SC、HB、LY和NQ種群的Tajimas D值為-2.574 1～-1.183 5，Fus F值為 ?-4.081 8～-2.300 3；甘肅CX和HX種群的Tajimas D值為 ?-1.685 0～-1.303 2，Fus F值在-2.313 4～-1.262 1。所有種群的Tajimas D和Fus F值均為負值，HB、NQ和YN種群表現極顯著，甘肅的CX種群也表現顯著，推測這4個種群近期經歷了明顯的種群擴張。

2.2 草地貪夜蛾不同地理種群的遺傳分化

通過Arlequin軟件計算草地貪夜蛾種群內的遺傳分化系數Fst，并根據Roussed提出的標準分析不同種群由遺傳結構引起的種群分化情況[32]。將12個種群兩兩組合分為66對（表3），有16對的Fst值極顯著高于其他43對（P< ?0.001），有7對的Fst值顯著高于其他43對（P< ?0.05）。在所有的12個地理種群中，SC分化尤為顯著，與HN、YN、GX、NQ、LY以及甘肅的HX、WX、CX和GG種群之間出現高度或極度分化，Fst分別為0.301 8、0.245 6、0.082 7、0.165 1、 ?0.298 6、0.234 4、0.260 5、0.293 5和0.296 3，與廣東種群的遺傳分化較低（Fst值為0.022 7）。

2.3 不同草地貪夜蛾地理種群間的基因流

66對草地貪夜蛾不同地理種群間的基因流（Nm）為0～無限大（inf），其中，45對草地貪夜蛾種群間的Nm大于4，表明這些種群間的基因交流普遍發生；有17個種群間的基因流Nm為1～4，表明這些種群間有中等程度的基因交流；4個種群間的基因交流有限（表3）。甘肅省CX、HX、WX、GG種群與周年繁殖區GX和YN種群間基因流均大于4，推測入侵甘肅的草地貪夜蛾可能主要來源于云南、廣西草地貪夜蛾的北遷西線。

Migrate軟件分析顯示，中國周年繁殖區GD種群、HN種群、GX種群和YN種群每世代的有效遷出數分別為4 195.66、5 650.99、4 565.66和3 565.67，每世代的有效遷入數分別為2 139.66、3 943.65、3 142.33和4 539.65。HN種群的有效遷入和遷出個體數之和較高，為中國草地貪夜蛾周年繁殖區的主要基因交流中繼站，YN種群的有效遷入個體數較高，推測為草地貪夜蛾由緬甸經云南持續入侵中國的原因。遷飛過渡區HB種群、SC種群、NQ種群和LY種群每世代的有效遷出數為4 299.65、4 876.34、4 896.33和 ?5 137.66，每世代的有效遷入數為3 616.99、 ?2 755.66、6 812.32和6 723.00，陜西NQ種群和LY種群的有效遷入和遷出個體數和較高，推測陜南的漢水谷地為中國草地貪夜蛾由南向北入侵的重要中轉基地。甘肅CX種群、GG種群、HX種群、WX種群每世代的有效遷出數為3 644.99，4 893.65、4 794.99和5 080.99，每世代的有效遷入數為6 734.33、4 334.99、6 083.67和4 776.33，其中CX種群和HX種群的有效遷入和遷出個體數總和較高，在甘肅省草地貪夜蛾進一步的北遷擴散中起著重要的作用（表4）。

3 結論與討論

草地貪夜蛾2019年已經在中國南方地區完成定殖過程，并隨季風往返于大部分省（區）發生為害，持續威脅中國的糧食生產安全[12]。2022年全國草地貪夜蛾的發生程度顯著高于往年，且發生北界北移3個緯度以上[33]，表明完成定殖后該蟲入侵勢頭的加劇。分子標記技術可以深入的分析草地貪夜蛾的種群遺傳分化及基因流，進而明確中國西北地區草地貪夜蛾的入侵來源及親緣關系，為該蟲的科學治理提供理論依據。本研究基于COI基因鑒定到12個草地貪夜蛾種群有多種單倍型，與陳冬平等的研究結果類似[34]，與草地貪夜蛾入侵初期云南種群只有1種單倍型的研究不一致[16，31]，原因可能與本研究選擇的COI基因母系遺傳特征有關，基于核基因組的Tpi基因能更準確地鑒定生物型，再者草地貪夜蛾在中國的持續入侵擴散進程中可能發生了遺傳雜交現象。本研究中12個草地貪夜蛾種群的單倍型多樣性指數為0.273，云南種群為0.230，顯著低于其他周年繁殖區種群，李向永等[31]的研究也發現云南種群的單倍型多樣性指數較低（0.047～0.214），可能由于云南為草地貪夜蛾經緬甸入侵中國的第一站，種群來源單一，種群遺傳多樣性不高，而入侵廣東、廣西的草地貪夜蛾種群數量多，來源廣，并已經在當地形成穩定種群。

Tajimas D中性檢驗和Fus F統計檢驗對種群擴張很敏感，在種群發生擴張時通常顯示為負值。本研究全部12個種群的Tajimas D中性檢驗和Fus F統計值均為負值，表明草地貪夜蛾自2019年侵入中國后經歷了明顯的種群擴張，且呈現持續的擴張態勢。湖北種群、寧強種群和云南種群的表現尤為顯著，原因可能是云南為草地貪夜蛾經緬甸入侵中國的第一站，湖北和陜西為草地貪夜蛾隨季風在中國由南向北遷移過程的主要中轉站。中性檢驗的結果也驗證了吳秋琳等[13]對草地貪夜蛾在中國西北地區的遷飛路線的預測。

12個種群的遺傳分化結構顯示，四川種群與廣東種群遺傳分化較低，與其他種群出現高度或極度分化，推測四川種群最初來源于廣東，遺傳分化可能與當地獨特的地理環境及農戶粗放的管理習慣有關。不同地理種群間的基因流Nm顯示，中國的絕大部分草地貪夜蛾種群存在中等程度以上的基因交流。此外，12個種群的有效遷移個數分析顯示，周年繁殖區的海南種群、陜西寧強種群、略陽種群、甘肅成縣種群和徽縣種群的個體遷移總和較高，推測以上種群為中國草地貪夜蛾的基因交流中繼站。基因流分析表明，陜南漢水谷地區域可能為中國草地貪夜蛾北遷的交匯中心，也是甘肅省草地貪夜蛾的主要入侵來源。甘肅隴南成縣和徽縣種群在草地貪夜蛾進一步向隴中、寧夏及內蒙的傳播擴散中起著重要的作用。因此，本研究遺傳分化結果也驗證了吳秋琳等[13]對草地貪夜蛾在中國西北地區遷飛擴散路徑的 ?預測。

本研究對草地貪夜蛾定殖中國后不同生態區劃12個地理種群的遺傳多樣性進行了解析，初步驗證了云南為中國草地貪夜蛾的最初入侵地，陜南的漢水河谷地區為草地貪夜蛾隨東南季風北遷的主要通道，甘肅隴南地形復雜且寄主類型豐富，是草地貪夜蛾進一步入侵中國西北的重要“中轉站”。但草地貪夜蛾在中國定殖時間尚短，本研究的采樣點偏少，覆蓋面不廣，今后應繼續加大采樣密度和頻次，更大尺度闡明中國草地貪夜蛾種群的遺傳結構變化及遷飛擴散路徑，為該蟲的綜合治理提供更為全面的科學數據。

作為典型的長距離遷飛性害蟲，草地貪夜蛾定殖后將隨季風“北遷南回”在中國各大糧食主產區發生為害。西北地區是中國重要的玉米、小麥、馬鈴薯及制種玉米生產基地，有效削減草地貪夜蛾的北遷基數對于中國糧食安全具有舉足輕重的作用。本研究表明漢水河谷地區是中國草地貪夜蛾夏季北遷西線的重要中轉地，鑒于此，今后西北地區草地貪夜蛾防控阻截的重點是在漢水河谷地區的陜南、甘肅隴南等地利用高空探照燈及性誘捕器等手段，加強對草地貪夜蛾遷飛成蟲的動態監控，并在復種玉米等重點作物持續開展幼蟲的田間監測，研發物理誘控與化學防治相結合的高效防治技術措施，做到早發現早消滅，最大限度壓低進一步北遷的蟲源基數。此外，基于中國日趨成熟的昆蟲雷達應用技術，建議在周年繁殖區云南、海南等地的草地貪夜蛾遷飛路線布設監測雷達，第一時間掌握成蟲的遷飛行為及遷飛方向。同時，在草地貪夜蛾周年繁殖區及遷飛過渡區持續開展田間種群的動態監測及抗藥性監測研究，并深入開展生物藥劑研發、生物天敵篩選、Bt玉米種植等生物、生態治理技術研究。在北方重點防范區集成研發草地貪夜蛾監測預警與應急防控技術，構建更為科學完善的全國草地貪夜蛾跨區聯動防控體系，確保草地貪夜蛾定殖后國內糧食安全及生態安全。

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Genetic? Diversity Analysis and Governance Strategy of Spodoptera frugiperda? Populations in Northwest China

Abstract This study aims to elucidate the invasion source and develop scientifically sound and effective prevention and control measures for Spodoptera frugiperda in Gansu province.Using molecular markers based on mtCOI gene，we analyzed the genetic diversity index，genetic differentiation coefficient and gene flow of S.frugiperda across 12 geographical populations in 8 provinces of China.The results showed that the haplotype diversity and average nucleotide difference in Gansu populations ranged from 0.133 to 0.157 and 0.133 to 0.317，respectively.These values were lower than thoose observed in Guangdong，Guangxi，and Yunnan populations within the annual breeding areas of China，which ranged from 0.157 to 0.819 and 1.033 to 7.705 respectively.Both Tajimas D neutral test and Fus F test yielded negative values across all populations，suggesting a significant population expansion event for S.frugiperda? following its invasion of China.There was genetic differentiation between Sichuan population and others，while gene flow? ?among 62 populations were found to be at an?? ?above-medium level.The cumulative effective emigration and immigration values for the Lueyang，Ningqiang，Huixian county and Chengxian county populations were 11 860.66，11 708.65，10 878.66 and 10 379.32，respectively.These play the role as relaying station in the process of gene exchange of S.frugiperda in China.The Hanshui Valley is an important corridor for the westward migration of S.frugiperda into the northwest in China.

Key words

Spodoptera frugiperda; mtCOI gene; Population genetic diversity; Genetic differentiation; Gene flow